6.1. СРЕДЫ ОБЩЕГО НАЗНАЧЕНИЯ

Учитывая отраслевые сырьевые особенности, в качестве основного компонента питательных сред может быть использовано зерновое, виноградное, плодово-ягод­ное или мелассовое сусло. Однако наиболее универсаль­ным и сбалансированным следует признать солодовое неохмеленное сусло с содержанием 8–10% СВ.

6.1.1. СОЛОДОВОЕ СУСЛО

Для приготовления сусла в лаборатории используют ячменный солод крупного помола с высокой осахаривающей способностью. В 1 л воды вносят 250 г солода и нагре­вают до 50°С. Через 30 мин температуру повышают до 55°С, а еще через 30 мин постепенно поднимают до 62,5–63°С. При этой температуре выдерживают до исчезнове­ния реакции на крахмал (йодная проба).

Полученное сусло отделяют от дробины путем фильт­рации через марлю и вату, раз­бавляют водой до нужной концентрации, разливают по колбам и стерилизуют при 112°С 30 мин. Если рН ниже 5,5, то сусло подщелачива­ют 10%-ным раствором соды или едкого кали до получе­ния рН 5,6–6,0. Полученное таким образом сусло жела­тельно очистить от примесей кизельгуром или отстаива­нием в холодильнике и фильтрацией через бумажный фильтр.

В отсутствие солодового вполне применимо зерновое сусло, осахаренное комплексом ферментных препаратов с обязательным внесением дрожжевой золки и 0,3–0,5% дрожжевого автолизата перед автоклавированием[1].

Для приготовления жидкой питательной среды осахаренное и отфильтрованное сусло разливают в колбы или пробирки на 1/2–3/4 объема, закрывают ватно-марлевыми пробками и автоклавируют 20 мин при 0,1 МПа.

6.1.2. МЕЛАССОВОЕ СУСЛО

Густую мелассу отвешивают на технических весах в количестве 200–300 г, смешивают с водой в соотношении 1:3 и нагревают до 75°С, затем насыпают 4% суперфосфата и повышают температуру до 85°С при постоянном помеши­вании. 33%-ный раствор едкой щелочи в количестве 0,8% по объему к исходной мелассе разводят в 30–50 см³ воды, до­бав­ляют к нагретой мелассе и хорошо перемешивают. В результате происходит выпадение осадка трикальцийфосфата, который увлекает за собой коллоиды мелассы и бо­лее крупные частицы, осадок быстро оседает на дно, и ме­ласса осветляется. После этого к мелассе добавляют 2,5% сернокислого аммония и 2% суперфосфата в виде вытяж­ки (1 г суперфосфата и 10 см³ воды нагревают до кипения и фильтруют через бумажный фильтр). Мелассу перемеши­вают с питательными солями и фильтруют через бумаж­ный фильтр, лучше под вакуумом на воронке Бюхнера.

Осветленную мелассовую среду разводят водой до тре­буемой концентрации 5–8% СВ по сахарометру и разли­вают в колбы, пробирки или бутылки; для приготовления твердых питательных сред добавляют агар.

Мелассовое сусло стерилизуют в автоклаве при избы­точном давлении 0,05 МПа 30 мин или в аппарате Коха при 100°С в течение 1 ч трое суток подряд.

6.1.3. СУСЛО-АГАР

В химическом стакане в сусло (8–10% СВ) внести не­обходимое количество агар-агара (2,5 г на 100 см³) и вы­держать 10–15 мин, не перемешивая до полного его увлажнения. Стакан поставить на слабый огонь и, постоян­но перемешивая, довести до кипения. Содержимое стака­на перелить в колбу до 1/2 объема, закрыть ее ватно-марлевой пробкой и автоклавировать 20 мин при 0,1 МПа.

Если питательная среда не требует внесения каких-либо термолабильных ингредиентов, то ее можно сразу после автоклавирования разливать в заранее приготов­ленные стерильные высушенные чашки Петри. Если же предполагается внесение антибиотиков, факторов роста или других чувствительных к температуре компонентов, то среду в колбе необходимо остудить до 40–45°С, сте­рильно внести нужные компоненты, перемешать и раз­ливать в чашки Петри. При этом желательно избегать образования комков для получения ровной поверхности питательной среды в чашках. После этого чашки со сре­дой не следует более перемещать, пока агар полностью не остынет.^***

Чтобы удалить образовавшийся конденсат и уменьшить его дальнейшее образование, чашки необходимо подсу­шить. Для этого чашки с агаром переворачиваются крыш­кой вниз, дно чашки с агаром извлекается и ставится на ребро крышки. В таком положении в боксе под УФ-лампой чашки выдерживаются ≈60 мин. Высушенные чашки закрываются и могут использоваться для работы либо хра­ниться в холодильнике завернутыми в полиэтиленовый пакет, чтобы исключить пересыхание или случайное об­семенение среды. Чашки, хранившиеся в холодильнике, перед работой следует некоторое время выдержать при комнатной температуре или в термостате.

6.1.4. СКОШЕННЫЙ СУСЛО-АГАР

Для приготовления скошенного сусло-агара доведен­ную до кипения среду (см. пп. 6.1.3) разливают в пробир­ки до 1/3 ее объема, закрывают ватно-марлевыми пробка­ми и автоклавируют 20 мин при 0,1 МПа. По окончании стерилизации пробирки с горячей средой раскладывают на наклонной поверхности для образования скоса нужной высоты и дают полностью застыть. Остывшие пробирки переносят в штатив и используют по назначению.

6.1.5.   ПОЛУЖИДКИЙ СУСЛО-АГАР

В химическом стакане в сусло (8–10% СВ) внести не­обходимое количество агар-агара (0,5 г/100 см³) и вы­держать 10–15 мин, не перемешивая до полного его ув­лажнения. Стакан поставить на слабый огонь и, посто­янно перемешивая, довести до кипения. Содержимое стакана разлить в пробирки до 1/3–1/2 объема, закрыть ватно-марлевыми пробками и автоклавировать 20 мин при 0,1 МПа.

По окончании стерилизации пробирки раскладывают вертикально в штатив и после полного их охлаждения ис­пользуют по назначению.

6.1.6.   АЦЕТАТНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ПОСТОРОННИХ ДРОЖЖЕЙ

На 1000 см³ водопроводной воды берут 10 г уксуснокис­лого натрия, 10 г хлористого аммония и 5 г глюкозы.

Дрожжевой автолизат добавляют в среду в количестве 3 см³.

Среду разливают в пробирки по 5 см³ и стерилизуют в автоклаве при избыточном давлении 0,05 МПа в течение 30 мин.

6.1.7.   СРЕДА С МОНОЙОДУКСУСНОЙ КИСЛОТОЙ

2%-ный сусло-агар после автоклавирования охлажда­ют до 50°С. В остывшую среду асептически вносят рабо­чий раствор монойодуксусной кислоты до концентрации 2,5% (97,5 см³ + 2,5 см³ кислоты). Приготовленную сре­ду тщательно перемешивают и разли­вают в чашки Петри. Конечная рН 5,8.

Посевы исследуемых проб инкубируют не менее 120 ч при 28–30°С.

На данной среде растут дрожжи, не относящиеся к роду Saccharomyces.

Рабочий раствор. В предварительно проавтоклавированную воду внести монойод­уксусной кислоты в количе­стве 7,44 мг на 1,0 см³.

6.1.8.   СУСЛО-ЖЕЛАТИН

К солодовому суслу концентрацией 8–10% СВ при­бавляют 15% желатина и через
30–40 мин, когда жела­тин набухнет, среду подогревают до 40–50°С, фильтруют через ватво-марлевый фильтр и разливают в пробирки или колбы.

Стерилизуют в аппарате Коха при 100°С по 30 мин трое суток подряд.

6.1.9.   СРЕДА САБУРО ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ ДРОЖЖЕЙ

К 100 см³ стерильной дрожжевой воды добавляют 5 г пептона, 4 г глюкозы, 1,8 г агара. После того как агар рас­плавится при нагревании, среду фильтруют и разливают в пробирки.

Стерилизуют 20 мин при избыточном давлении 0,05 МПа или в аппарате Коха дробной стерилизацией.

6.1.10. СИНТЕТИЧЕСКАЯ СРЕДА С ЛИЗИНОМ

Рецептура синтетической среды с лизином следующая.

Глюкоза............................................................ 50 г

Лизин.................................................................. 3 г

KH₂PO₄................................................................ 1 г

MgSO₄................................................................. 1 г

FeSO₄............................................................. следы

Каждый компонент среды растворяют в воде отдель­но, смешивают в указанном порядке и доводят водопро­водной водой до 1000 см³.

В полученную жидкую синтетическую среду вносят агар (2,5%), расплавляют и разливают в пробирки по 10 см³. Среду стерилизуют 20 мин при давлении 0,05 МПа.

После автоклавирования пробирки ставят в штатив для получения скошенной среды.

6.1.11. СРЕДА 10 ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ И ПОДСЧЕТА
ЛАКТОБАКТЕРИЙ И ЛЕЙКОНОСТОКА

На 1000 см³ неохмеленного солодового сусла (8% СВ) или 1000 см³ дрожжевой воды добавляют 0,05 г MnSO₄·4H₂O, по 0,2 г MgSО₄·7H₂О, цистина или цистеина, Kh₂po₄, цитрата аммония, 2,5 г ацетата натрия, 20 г сахарозы, 10 г пеп­тона и 50 см³ дрожжевого автолизата.

Каждый компонент среды растворяют в указанном порядке в солодовом сусле (для выращивания лактобактерий) или дрожжевой воде (для выращивания лейконостока). В первом случае рН среды 5,5, во втором – 6,0.

Растворив все компоненты и нормализовав рН, добав­ляют 2,5% агара и стерилизуют троекратно текучим паром.

Перед использованием в расплавленную среду добав­ляют стерильный мел (3% к объему среды), тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри.

6.1.12. МОЛОЧНЫЙ АГАР БОГДАНОВА

Используется в качестве среды для выявления и учета гнилостных бактерий.

Обезжиренное молоко разливают в пробирки по 5 см³ и троекратно стерилизуют текучим паром либо 20 мин при 0,05 МПа. Отдельно готовят 5%-ный водный агар, разли­вают его в пробирки по 4–5 см³ и стерилизуют 30 мин при давлении 0,1 МПа.

Перед посевом водный агар расплавляют, соединяют с молоком, и смесь выливают в чашки Петри, куда предва­рительно была внесена исследуемая проба.

6.1.13. ВИНОГРАДНОЕ СУСЛО

Сусло помещают в колбу и нагревают до кипения в кипятильнике Коха, после охлаждения отфильтровы­вают от выпавших белковых веществ через бумажный складчатый фильтр и разливают в пробирки по 5 см³, стараясь не смочить горлышка, затем в пробирках пас­теризуют.

Предназначается для выращивания дрожжей.

6.1.14. ВИНО С САХАРОМ

В белое сухое вино добавляют 5–10% сахара. После его растворения среду фильтруют и разливают по пробиркам.

Среда используется для посева дрожжей и уксуснокис­лых бактерий.

6.1.15. ВИНО С СУСЛОМ

Среда состоит из виноградного сусла – 1/3 объема, сухого вина – 1/3 и водопроводной воды – 1/3 объема. Среду фильтруют и разливают в пробирки.

Рекомендуется для посева уксуснокислых бактерий.

6.1.16. ВИНОГРАДНОЕ СУСЛО РАЗБАВЛЕННОЕ

Сусло разбавляют водой до содержания сахаров 5%, добавляют 1% автолизата дрож­жей и доводят рН до 5–6 добавлением 1 Н раствора щелочи.

Среда рекомендуется для молочнокислых бактерий.

6.1.17. ЯБЛОЧНОЕ СУСЛО

В свежий или консервированный яблочный сок добав­ляют при необходимости сахар до массовой концентрации 10–12 г/100 см³. Концентрация титруемых кислот не долж­на превышать 6–7 г/дм³. При излишней кислотности сок разбавляют водой.

Стерилизуют в автоклаве текучим паром или в кипя­тильнике Коха однократно в течение 40–45 мин.

Применяют для культивирования дрожжей.

6.1.18. СМЕСЬ СОЛОДОВОГО СУСЛА С ЯБЛОЧНЫМ

В состав среды входят: солодовое сусло с 5% сухих ве­ществ – 1/2 объема и яблочное сусло – 1/2 объема. Сре­ду осветляют, стерилизуют текучим паром 3 дня подряд по 30 мин.

Предназначается для выращивания молочнокислых бактерий.

6.1.19. КАПУСТНАЯ СРЕДА

200 г измельченной капусты помещают в кастрюлю, заливают 1000 см³ воды и кипятят в течение 10 мин, за­тем отжимают через двойной слой марли. Полученную жидкость фильтруют и в 2 раза разбавляют водой. К отва­ру добавляют 2% глюкозы и 1% пептона или 25 см³ соло­дового сусла (10% СВ) и 1,25 см³ кукурузного экстракта.

Для приготовления среды можно использовать сухую капусту. Измельченную капусту следует сушить в тени при температуре 20–35°С при потоке свежего воздуха. Для приготовления питательной среды 6–8 г сухой капусты кипятят в 1000 см³ воды. Среду разливают в пробирки высоким столбиком по 5–10 см³, стерилизуют в автокла­ве при 121°С в течение 30 мин.

Среда предназначена для накопления и выделения молочнокислых бактерий, с добавлением спирта 0,95 см³ на 5 см³ среды.

6.1.20. КАРТОФЕЛЬНАЯ ВОДА

20 г очищенного от кожуры и протертого сырого кар­тофеля добавляют к 1000 см³ водопроводной воды, настаи­вают 4 ч, кипятят 15 мин, фильтруют через складчатый фильтр, разливают в пробирки по 5 см³ и стерилизуют при избыточном давлении 0,1 МПа в течение 20 мин.

6.1.21. ДРОЖЖЕВАЯ ВОДА

На 1000 см³ водопроводной воды берут 80 г прессован­ных дрожжей или 20 г сушеных, смесь кипятят в течение 20 мин, разливают в бутылки и стерилизуют при избыточ­ном давлении 0,1 МПа в течение 30–40 мин.

После отстаивания в течение нескольких дней дрож­жевая муть оседает, а дрожжевая вода становится про­зрачной.

6.1.22. ДРОЖЖЕВОЙ АВТОЛИЗАТ

Вариант 1. Для приготовления можно использовать прессованные или сушеные пекар­ские дрожжи.

200 г прессованных дрожжей размешивают с 100 см³ водопроводной воды или 100 г сушеных дрожжей с 400 см³ воды, добавляют поваренной соли в количестве 0,15% к весу прессованных дрожжей и 0,5% к весу сушеных дрож­жей, смесь помещают в термостат при 50–­55°С на 48 ч, затем нагревают до кипения и фильтруют через складча­тый бумаж­ный фильтр, разливают в стеклянную посуду и стерилизуют при избыточном давлении 0,1 МПа в тече­ние 30 мин.

Вариант 2. Прессованные дрожжи заливают равным по массе количеством воды: полу­ченную суспензию кле­ток покрывают тонким слоем толуола и выдерживают трое суток при температуре 60°С, время от времени перемеши­вая. После этого суспензию несколько минут кипятят, дают остыть и с помощью 1 Н раствора КОН доводят зна­чение рН до 6, затем отстаивают. Надосадочная жидкость (дрожжевой автолизат) должна быть прозрачной, ее сли­вают и отфильтровывают через бумажный фильтр на во­ронке Бюхнера под разряжением.

Стерилизуют автоклавированием 20 мин при 112°С.

Таблица 6

Состав основных синтетических сред

6.1.23. СТЕРИЛЬНЫЙ МЕЛ

Имеющийся в продаже мелкоразмолотый мел насы­пают в стерильные пробирки с ватными пробками по 0,3–0,5 г и стерилизуют сухим жаром 1 ч при 170°С.

6.1.24. СТЕРИЛЬНАЯ ВОДОПРОВОДНАЯ ВОДА

Водопроводную воду разливают в пробирки по 10 или 9 см³ и в колбы по 50 и 100 см³, закрывают ватными проб­ками и стерилизуют в автоклаве 30 мин при давлении 0,1 МПа или в аппарате Коха при 100°С по 1 ч трое суток подряд.

6.2. СРЕДЫ НАКОПИТЕЛЬНЫЕ ДЛЯ ДРОЖЖЕЙ

Приготовленные среды автоклавируются при 0,1 МПа в течение 20 мин. Могут использоваться как осно­ва для агаризованных сред.

При необходимости вносятся антибиотики.

Состав и количество ингредиентов накопительных сред показаны в таблице 7.

Таблица 7

Среды накопительные для дрожжей

6.3. СРЕДЫ ДЛЯ АСКОСПОРООБРАЗОВАНИЯ

6.3.1. СРЕДА ГОРОДКОВОЙ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ СПОР У ДРОЖЖЕЙ

Состав среды следующий.

Пептон...................................... 1,0 г

Поваренная соль....................... 0,5 г

Глюкоза................................... 0,25 г

Агар .......................................... 2,0 г

Вода............................. до 100,0 см³

Иногда вводят еще 1% мясного экстракта.

Среду нейтрализуют содой (питьевой) до рН 7,3, дово­дят до кипения и кипятят до тех пор, пока не расплавится агар, фильтруют и разливают в пробирки по 5 см³.

Стерилизуют при избыточном давлении 0,05 МПа в течение 20 мин.

6.3.2.   АЦЕТАТНЫЙ АГАР ФОУВЕЛЛА

На 1000 см³ дистиллированной воды берут 5 г CH₃COONa·3H₂O и 20 г агара. рН среды должно быть 5–7. Автоклавируют 15 мин при 121°С.

6.3.3.   АЦЕТАТНЫЙ АГАР МАК-КЛАРИ

CH₃COONa·3H₂O.......................... 8,2 г

Глюкоза......................................... 1,0 г

KCl................................................. 1,8 г

Дрожжевой экстракт..................... 2,5 г

Агар............................................. 15,0 г

Дистиллированная вода до 1000,0 см³

Автоклавируют 15 мин при 121°С.

6.3.4.   СРЕДА С ДРОЖЖЕВЫМ ЭКСТРАКТОМ И ГЛЮКОЗОЙ

Дрожжевой экстракт.................... 5,0 г

Глюкоза....................................... 50,0 г

Агар............................................. 20,0 г

Дистиллированная вода. до 1000,0 см³

Автоклавируют 20 мин при 112°С.

6.3.5.   АГАРИЗОВАННАЯ ДРОЖЖЕВАЯ ВОДА

Готовят, добавляя к 1000 см³ дрожжевой воды 15 г агара.

Автоклавируют 15 мин при 121°С.

6.3.6.   СРЕДА СТАРКИ

K₂HPO₄.............................................................. 1,0 г

CaCl₂........................................... 0,05 г

KH₂PO₄ .......................................  0,25 г

MgSO₄·7H₂O............................... 0,25 г

Агар............................................ 20,0 г

Водопроводная вода ..... до 1000,0 см³

Автоклавируют 15 мин при 112°С.

После стерилизации добавляют 6,0 см³ этилового спирта.

6.3.7.   ОВОЩНОЙ АГАР

Предварительно готовят экстракт овощей путем авто­клавирования 10 мин при 112°С равных частей промытых и мелко нарезанных моркови, сахарной свеклы, огурцов и картофеля в четырех частях воды, после чего экстракт отфильтровывают через ткань, отжимая осадок.

К 1000 см³ полученного экстракта (4% СВ, рН 6,7) до­бавляют 20 г сухих дрожжей и 20 г агара.

Автоклавируют 15 мин при 121°С.

6.3.8.   ГИПСОВЫЕ БЛОКИ

Восемь частей гипса (2CaSO₄·H₂O) смешивают с тремя частями воды и помещают пасту в цилиндрические фор­мы из бумаги или фольги высотой 3–4 см. Поверхность тщательно сглаживают. После застывания блоки освобо­ждают от форм, помещают в вы­сокие чашки и стерилизу­ют при 110–120°С в течение 2 ч. Перед посевом в чашки нали­вают стерильной воды слоем 1 см или раствор, содер­жащий 1% маннита и 0,5% K₂HPO₄.

На средах для спорообразования дрожжи инкубируют при температурах, несколько мень­ших в сравнении с оп­тимальными для вегетативного роста, – в большинстве случаев при 20–25°С.

Время инкубации составляет до 4–6 недель при еже­недельном микроскопировании.

Начинающие исследователи нередко затрудняются отличить аскоспоры от внутриклеточных бесполых спор (эндоспор) или от крупных глобул жира. В таких случаях можно прибегнуть к окраске (см. п. 4.2). Формы спор дрож­жей представлены на рисунке 16.

Рис. 16

Споры дрожжей:

а – споры Saccharomyces; б – споры Debaryomyces или Torulaspora; в – споры Zygosaccharomyces; г – шляповидные споры Ptchla membranaefaclens; д – са-турновидные споры Pichía spp. и Williopsis saturnus; е – бобовидные споры Kluyveromyces marxianus и Schizosaccharomyces spp.

6.4. ОСВЕТЛЕНИЕ СРЕД

Осветленные жидкие, агаризованные или жела­тиновые среды необходимы в диагностических исследова­ниях и для получения хорошо видимых признаков глубин­ного роста и изолированных колоний микроорганизмов.

В ряде случаев прозрачную среду можно получить, от­фильтровав ее от осадка через вату. Когда этого бывает недостаточно, среды осветляют с помощью белков кури­ных яиц. Для осветления 500 см³ среды достаточно белка одного яйца. Белок тщательно отделяют от желтка и встря­хивают с равным объемом воды до образования густой пены. Взбитый белок выливают в предварительно расплав­ленную и затем остуженную до 45–50°С среду. Перед вне­сением белка проверяют значение рН среды и, если необ­ходимо, среду подщелачивают до рН 7,0–7,3. Среду с бел­ком тщательно перемешивают и прогревают в кипящей водяной бане в течение часа. Белок свертывается и адсор­бирует все взвешенные в среде частицы. Среду быстро от­фильтровывают в горячем виде через вату.

Синтетические агаризованные среды, внесение белка в которые нежелательно, осветляют следующим образом. Среду, налитую в химический стакан, автоклавируют и оставляют после стерилизации в закрытом автоклаве на 10–12 ч. При таком медленном остывании среды все взве­шенные частицы оседают на дно. Застывшую среду извле­кают из стакана, прозрачную часть среды срезают, поме­щают в колбу и вновь стерилизуют.

6.5. ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ И УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР ДРОЖЖЕЙ

Длительное поддержание чистых культур мик­роорганизмов, без потери активности и производственных качеств, необходимо как при хранении в коллекциях и проведении научно-исследовательских работ, так и при эксплуатации в производстве.

Основной задачей при хранении чистых культур про­мышленных штаммов микро­организмов в музейных кол­лекциях является правильный выбор условий для сохра­нения их производственно ценных свойств. Общей тенден­цией при этом является максимальное замедление всех жизненных процессов, что достигается различными прие­мами. Жизнеспособность клеток при этом должна быть сохранена. Кроме того, способы хранения культур долж­ны быть по возможности менее трудоемки и надежны.

Из-за различий биологических свойств видов невоз­можно использовать с равно­ценными положительными результатами один общий способ хранения для разных культур дрожжей. Большой опыт по хранению культур микроорганизмов, в том числе и дрожжей, накоплен со­трудниками крупных национальных коллекций, в кото­рых имеется возможность проверять и оценивать разные методы хранения применительно к широкому набору дрожжевых организмов.

Наиболее широко применяемый способ – это поддер­жание культур путем их перио­дических пересевов. В пос­ледние два десятилетия получили распространение так­же методы хранения микробных культур под минераль­ным маслом и лиофильная сушка. Так как эти три метода применяются уже много лет, то имеется возможность срав­нительной оценки их пригодности для хранения разных видов дрожжей. Другие, менее широко используемые или недавно разработанные методы можно рекомендовать лишь для проверки с обязательным дублированием культур, ко­торые поддерживаются обычными способами.

6.5.1. ПЕРИОДИЧЕСКИЕ ПЕРЕСЕВЫ

Обычно культуры поддерживают, пересевая их на агаризованных средах в двойной повторности. Одна пробир­ка, которую после засева совсем не открывают, служит кон­трольной, а из второй по мере надобности делают отсевы.

Частота пересевов. Сроки пересевов определяют для большинства культур дрожжей скоростью высыхания сре­ды. Она зависит от температуры и влажности помещения, где хранят пробирки.

Промежутки между пересевами можно увеличить за счет более плотного заку­поривания пробирок и снижения температуры хранения. Так, использование пробирок с завинчивающимися металлическими крышками вместо обычных ватных пробок предохраняет от высушивания, но хуже обеспечивает чистоту сохраняемых культур. При­менение вазелинового масла для снижения скорости вы­сыхания культур также имеет свои недостатки, о чем речь будет идти ниже. Поэтому хорошо сделанные ватные проб­ки (их можно сверху заливать парафином) все же остают­ся лучшим средством закрывания пробирок. Они обеспе­чивают достаточный газообмен, хорошо предохраняют от микроб­ного загрязнения и легко изготовляются.

Ватные пробки, однако, не предохраняют культуры от заражения их микофильными клещами (mites). Для про­филактики используют следующий прием. Перед посева­ми или пересевами культур пробку слегка выдвигают из пробирки и наносят на нее каплю раствора, содержащего 10 г сулемы, 50 см³ глицерина, 500 см³ этилового спирта и 450 см³ воды. Затем пробку вдвигают в пробирку и не­сколько раз проворачивают ее, чтобы смочить внутренние стенки пробирки. В раствор можно добавить какой-либо краситель для контроля равномерности смачивания.

Температура. Если хранение ведется при температуре в пределах 15–20°С, то после пересева пробирки сразу же помещают в коллекционное помещение, за исключением тех культур, которые требуют для роста более высокой температуры. Психрофильные дрожжи выращивают и хранят при 3–4°С в холодильнике. При низкой темпера­туре после появления хорошего роста можно хранить и все другие дрожжи.

Среды. Во многих лабораториях и коллекциях дрож­жи поддерживают и хранят на сусло-агаре. Было показа­но, однако, что на этой сложной среде при длительном хра­нении происходит изменение физиологических свойств, характерных для вида, за счет адаптации или стабилиза­ции мутантов. В связи с этим для хранения более пригод­на среда следующего состава, которую используют для гол­ландской коллекции.

Глюкоза........................................ 4,0 г

Пептон........................................... 0,5 г

Дрожжевая вода
рН 5,8-6,0......................... до 100,0 см³

Для винных дрожжей предложена среда, на которой дрожжи хорошо спорулируют и долго хранятся.

Морковь тертая............................ 125 г

Вода ......................................  1000 см³

Настоять 1 ч, довести
до кипения, кипятить 10 мин,
отфильтровать через вату, рН 5.

Агар................................................ 30 г

Пивоваренные дрожжи лучше поддерживать на сус­ло-агаре или среде следующего состава.

Сусло............................................... 3%

Дрожжевой экстракт ....................... 3%

Пептон............................................. 5%

Глюкоза............................................ 1%

Агар ................................................. 2%

На дрожжевых и спиртовых заводах, работающих на мелассе, для хранения производственных культур лучше использовать среду следующего состава.

Мелассовое сусло 5% СВ........ 100 см³

Солодовое сусло 12% СВ........ 100 см³

Дрожжевой автолизат.................. 2 см³

Агар.................................................. 5 г

В некоторых коллекциях дрожжи поддерживают в жидких средах (сусло с дрожжевым автолизатом, пепто­ном и глюкозой) с пересевами через 4 мес.

6.5.2. ХРАНЕНИЕ ПОД МИНЕРАЛЬНЫМ МАСЛОМ

Заливка агаровых культур минеральным маслом пре­следует цель задержать высыхание и тем самым увели­чить сроки пересевов.

Для заливки культур дрожжей наиболее пригодно высокоочищенное медицинское вазелиновое масло плотно­стью 0,8–0,9. Масло стерилизуют в автоклаве в течение 1 ч при 121°С, а затем прогревают для удаления влаги в сушильном шкафу при температуре не выше 150°С или выдерживают при комнатной температуре не менее 2–3 дней.

Дрожжи выращивают на сусло-агаре или другой сре­де, выбранной для хранения.

Среду готовят в пробирках таким образом, чтобы стол­бик был достаточно высоким, а скос небольшим.

Через 4–6 суток, когда штрих хорошо сформируется, культуры заливают маслом таким образом, чтобы слой его над верхним краем агарового косяка не превышал 1 см. После заливки культуры хранят в вертикальном положе­нии либо при комнатной температуре, либо в холодиль­нике при 4–6°С.

Пересев дрожжей из-под вазелинового масла произво­дят один раз в год. Для пересевов используют свежие ско­шенные агаризованные среды, на которых культуры хра­нились.

Опыт многих коллекций свидетельствует об успешных результатах этого способа хранения дрожжевых культур. Для винных дрожжей, в частности, было показано, что при хранении под вазелиновым маслом с пересевами даже через 2–4 года они не теряют бродильных свойств и хо­рошо выживают. Имеются указания на сохранение жи­вых клеток дрожжей под маслом до 10 лет и более без пересевов.

К недостаткам этого метода хранения следует отнести следующие:

• при пересевах масло смешивается с инокулятом, и штрихи получаются хуже обычных;
• масло разбрызгивается при обжигании петли, и от этого возникает возможность инфицирования помещения;
• требуется специальная очистка использованных пробирок от масла;
• при стерилизации масла высокими температурами в нем могут образовываться токсичные для дрожжей ве­щества.

С учетом всех преимуществ при достаточном опыте персонала и правильной организации работы в лаборато­рии перечисленными недостатками можно пренебречь.^***

6.5.3. ЛИОФИЛИЗАЦИЯ

Лиофилизацией называют процесс высушивания под вакуумом из замороженного состояния. Техника лиофилизации и хранения лиофилизированных культур сильно варьи­рует в разных лабораториях. Вариации касаются сред и сроков выращивания, применения суспензионных жидкостей, температуры замораживания, условий хране­ния и восстанов­ления культур.

Дрожжи, подлежащие лиофилизации, выращивают в оптимальных условиях на средах, не слишком обогащен­ных питательными веществами. Для этой цели пригодна среда Сабуро или глюкозопептонная следующего состава.

Глюкоза........................................................... 1,0 г

Пептон.............................................................. 1,0г

Мясной и дрожжевой
экстракты по.................................................. 0,5 г

NaCl ...............................................................  0,5 г

К₂НРO₄............................................................. 0,3 г

Агар................................................................. 2,5 г

Вода.................................................... до 100,0 см³

Дрожжи выращивают и на сусло-агаре. Из 2–5-суточных культур готовят густую суспензию в специальных суспензионных жидкостях, содержащих защитные веще­ства, которые можно разделить на три группы:

• коллоидные среды животного, растительного и ми­нерального происхождения, такие как сыворотка крови, плазма, желатина, снятое молоко, агар-агар, гель гидра­та окиси алю­миния и др.;
• среды с углеводами (чаще всего 10%-ный раствор сахарозы) и продуктами гидро­лиза белков – пептоном и аминокислотами;
• сложные среды, в состав которых входят вещества, образующие как коллоидные, так и истинные растворы.

Хорошие результаты получены в голландской коллек­ции (CBS, г. Дельфт) при использовании в качестве защит­ной среды раствора, содержащего 7,5% инозита, 2% глу­тамата натрия и 5% декстрина. рН такой среды доводят до 7,0 с помощью NaOH.

Ниже приведены 2 варианта сложных защитных сред.

Вариант 1.

Желатина......................................................... 1%

Дрожжевой экстракт..................................... 1%

Глюкоза.......................................................... 0,5%

Аскорбиновая кислота............................. 0,25%

Дистиллированная вода................. до 100,0%

рН........................................................................ 5,5

Вариант 2.

Пептон.............................................................. 15 г

Бычья сыворотка..................................... 100 см³

Сахароза.......................................................... 30 г

Дистиллированная вода...................... 200 см³

Использование 10–20%-ного раствора сахарозы дает хорошую выживаемость сразу после лиофилизации, но при длительном хранении жизнеспособность дрожжей резко снижается из-за высокой остаточной влажности материала.

Важным моментом в процессе лиофилизации являет­ся замораживание суспензии. Для дрожжей при лиофи­лизации обычно применяют охлаждение от –30°С до –70°С, однако температура около –15°С, способствующая медленному замораживанию, дает наилучшие результа­ты. Есть указания также на успешное использование ре­жима быстрого замораживания дрожжей при температу­ре смеси сухого льда и спирта –78°С и сверхбыстрого за­мораживания в жидком азоте при –196°С.

Замороженный материал не должен оттаивать в про­цессе высушивания. Продол­жительность высушивания меняют в зависимости от обрабатываемого материала, его объема, состава защитной среды и используемой аппарату­ры. Чем мельче кристаллы, образовавшиеся при замора­живании, тем быстрее проходит высушивание. Остаточная влажность сказывается на сохранении свойств лиофилизированных дрожжей и на продол­жительности последую­щего их хранения без потери жизнеспособности.

Сразу же после окончания процесса лиофилизации важно определить жизне­способность обработанной куль­туры, а в случае, когда была известна концентрация жи­вых клеток в исходной суспензии, можно установить и процентное отношение оставшихся живыми от начально­го количества клеток.

Реактивацию лиофилизированных культур произво­дят путем переноса части матери­ала либо сразу же в жид­кую питательную среду, либо путем предварительного 8-часового выдерживания в дистиллированной воде с по­следующим пересевом на сусло-агар.

Запаянные ампулы с лиофилизированными культура­ми хранят в темноте при комнатной температуре или в холодильнике с температурой 4–6°С. Последнее предпоч­тительнее, особенно для дрожжей с высокой остаточной влажностью материала.

Итоги 19–20-летнего хранения культур дрожжей – представителей 17 родов, всего 557 штаммов – в голланд­ской коллекции позволили установить разную пригод­ность этого метода хранения для отдельных видов. Дрож­жи с мелкими клетками и аскоспорами, такие как Pichia, Hansenula и Debaryomyces, показали хорошую выживае­мость, а крупно­клеточные слабоспорулирующие или неспорулирующие дрожжи родов Saccharomyces, Kluyveromyces, Dekkera и Brettanomyces выживали хуже.

Таким образом, и этот широко применяющийся сей­час метод хранения микробных культур не следует рас­сматривать как универсальный, одинаково пригодный для разных видов дрожжей.

6.5.4. МЕТОДЫ  КРИОГЕННОГО ХРАНЕНИЯ

Замораживание дрожжей проводят при разных режи­мах, включая температуры от –10 до –196°С и различные скорости охлаждения. Устойчивость дрожжей к повреж­дающим эффектам при замораживании повышается при добавлении защитных веществ: глицерина, сахарозы, ино­зита, диметилсульфоксида, полиэтиленгликоля.

В ампулу объемом 1,2 мл вносят 0,2 мл суспензии кле­ток дрожжей из стационарной фазы (начальная концентра­ция клеток 10⁶–10⁸ клеток/см³), 0,5 см³ 10%-ного раство­ра глицерина, 6%-ного инозита или другого защитного вещества. Ампулы запаивают и помещают в жидкостно-фазовый рефрижератор с температурой –70°С со скоростью охлаждения 1–2,5°С в минуту в зоне критических темпе­ратур — от –5 до –35°С. Замороженные микроорганизмы хранят в жидком азоте при –196°С в металлических кон­тейнерах или стеклянных дьюарах. Существуют контей­неры-рефрижераторы разного объема:

• 10 л на 250 ампул для краткосрочного хранения в экспериментальной работе;
• 35 л на 900 ампул в канистрах;
• 185 л на 12 000 ампул или 1000 штаммов в 12 повто­рениях.

Для быстрого оттаивания ампулы погружают в водя­ную баню с температурой 35–45°С на 2 мин. При этом не­обходимо защитить глаза от возможного взрыва неплотно запаянных ампул. Высев производят на богатую питатель­ную среду.

Трехлетнее хранение пивных дрожжей в жидком азо­те показало хорошую их выживаемость без изменения цен­ных производственных свойств.

6.5.5. ХРАНЕНИЕ НА АДСОРБЕНТАХ

В качестве адсорбентов используют почву, песок, као­лин, силикагель, вату и фильтровальную бумагу. Этот спо­соб хранения не имеет разработанной стандартной тех­ни­ки. Высокая выживаемость и физиологическая активность обеспечивается при хра­нении дрожжей в силикагеле, со­держащем различные микроэлементы. Двухсуточные куль­туры дрожжей, полученные на синтетической среде с 1% парафина на качалках, смешивали со 150 см³ стерильных шариков силикагеля и оставляли в термостате при 32°С на 24 ч. Через сутки определяли рН среды и доводили при необходимости до 7–8. Затем культуральную жидкость сливали, шарики силикагеля с дрожжами помещали в сте­рильные  чашки Петри и высушивали в эксикаторе при пониженном давлении в течение 5–6 суток. После высу­шивания культуры дрожжей хранили в течение года при комнатной температуре в запаянных стеклянных ампу­лах при давлении 13,33 кПа. Для реактивации 200 мг шариков силикагеля измельчали в фарфоровой ступке, порошок переносили в
3–5 мл стерильной воды и после кратковременного выдерживания делали высев на пита­тельную среду.

Описан способ хранения дрожжевых культур на вате и полосках фильтровальной бумаги, в 10% -ном растворе сахарозы в почве.

6.5.6. ХРАНЕНИЕ КУЛЬТУР ВИННЫХ ДРОЖЖЕЙ В ВИДЕ СПОР

На сусловых средах винные дрожжи плохо спорулируют и быстро отмирают.
В. В. Абрамовичем был разрабо­тан метод получения активно спорулирующих культур для длительного хранения их в состоянии спор.

Дрожжевой осадок из сброженного сусла переносят на 2–3%-ный голодный (водный) агар, где 60–80% клеток образуют споры. Дрожжи сохраняют жизнеспособность на этой среде до двух и более лет. Этим способом было прове­рено 18 рас винных дрожжей. Подавляющее большинст­во проверенных культур вызывало активное брожение через
1,5–2,2 года хранения.

Н. И. Бурьян предложила для винных дрожжей спо­соб хранения без потери их основных производственно ценных свойств (энергии размножения и дыхания, бро­дильной активности, кислотоустойчивости, спиртоустойчивости) путем чередования периодов активного размно­жения и пребывания в состоянии спор.

Дрожжи предварительно выращивают 48 ч на среде с 5% (по объему) автолизата пивных дрожжей и 2% глюко­зы, переносят для спорообразования на измененную сре­ду Адамса (2% агара + 0,14% уксуснокислого натрия), затем 10 суток выдерживают при 15°С, а для длительно­го хранения переносят в помещение с температурой 10°С. Через 9– 10 мес. дрожжи переводят в активное состояние, засевая споровым материалом колбы со средой, содержа­щей 18–20% сахара (рН 2,7–3,0), а по окончании броже­ния – в новую серию колб, среда в которых содержит 28–30% сахара (рН 5,5). Эти пересевы занимают прибли­зительно 2 мес, после чего дрожжи вновь переносят на голодный агар.

6.5.7. ХРАНЕНИЕ МИКРОБНЫХ КУЛЬТУР ПОД ВАКУУМОМ
(МЕТОД СОРДЕЛЛИ)

Небольшое количество дрожжей с агаровой среды вво­дят в маленькую пробирку, которую закрывают ватной пробкой. Пробирку помещают в более крупную пробирку из тугоплавкого стекла. На ее дно предварительно вносят несколько стеклянных бус и кристаллов КОН. Пробирку закрывают резиновой пробкой со стеклянной трубкой, через которую производят откачку воздуха до 1,3–6,6 кПа. Трубку запаивают парафином. Пробирки хранят при ком­натной температуре.

6.5.8. ХРАНЕНИЕ КОЛЛЕКЦИОННЫХ КУЛЬТУР ДРОЖЖЕЙ В ДИСТИЛЛИРОВАННОЙ ВОДЕ (МЕТОД КАСТЕЛЛАНИ)

Пробирки с 8–10 см³ стерильной дистиллированной воды засевают большим коли­чеством инокулята с глюкозного или суслового агара и хранят при комнатной темпе­ратуре. По мере испарения воды ее добавляют в пробир­ки. Жизнеспособность дрожжей сохраняется в этих усло­виях до двух лет и более. Основным условием успешного хранения дрожжей в дистиллированной воде является обильный инокулят.

Этот способ оказался непригодным для таких слабоспорулирующих дрожжей, как Hanseniaspora, Endomycopsis, Nematospora  и некоторых Saccharomyces.

6.5.9.   ХРАНЕНИЕ В МАННИТЕ

Предлагается способ хранения дрожжей в активной форме, при котором чистую культуру суспендируют в 10%-ном растворе маннита, играющего роль осмотическо­го стабилизатора, с добавлением 0,2% b-фенилэтанола в качестве бактерицидного агента.

При концентрации биомассы дрожжей 1,0–2,5·10⁸ кле­ток/см³ и температуре хранения 25°С гарантируется со­хранение свойств дрожжей в течение года.

6.5.10. ХРАНЕНИЕ МАТОЧНЫХ ХЛЕБОПЕКАРНЫХ И СПИРТОВЫХ ДРОЖЖЕЙ

Маточные дрожжи, обладающие высокой ферментатив­ной активностью, стойкостью и микробиологической чис­тотой, проявляют хорошую устойчивость при хранении. Но даже незначительные отклонения от требуемых показате­лей приводят к быстрой потере актив­ности культуры. Для хранения маточных дрожжей ЧК (чистая культура) и ЕЧК (есте­ственно чистая культура) в виде молока устанавлива­ют по два сборника из нержавеющей стали, чтобы создать условия их попеременной мойки и профилактического ремонта. Сборники должны быть снабжены мешалками, охлаждающими системами, указателями уровня и вынос­ными термометрами.

При монтаже сборников предусматривают возмож­ность самостоятельной промывки и пропарки любого уча­стка трубопровода в любом направлении, в том числе и на выпуск в канализацию.

За техническим состоянием коммуникаций, змееви­ков и всей запорной арматуры маточного отделения дол­жен быть строгий надзор.

Для стабилизации и улучшения исходных показате­лей культуры при хранении дрожжей ЧК рекомендуется использовать добавки из расчета на 1 кг прессованных дрожжей (табл. 8).

Таблица 8

Стабилизаторы маточных дрожжей ЧК

На Воронежском дрожжевом заводе смонтирован спе­циальный сборник-термостат, снабженный барботером и охлаждающей рубашкой. К суспензии хранящихся дрож­жей добавляют расчетное количество мелассы при темпе­ратуре 10–12°С, выдерживают 2–3 ч до возникновения слабого спиртового брожения, затем охлаждают до 1°С и хранят при этой температуре. Конвективные токи CO₂, выделяющиеся в процессе брожения, удерживают дрож­жи во взвешенном состоянии.

Суспензию для засева можно подавать непосредствен­но из термостата, в котором создается избыточное давле­ние 30 кПа (0,3 кгс/см²), поэтому термостат лучше уста­навливать в непосредственной близости к дрожжерастильным аппаратам.

[1] Здесь и далее обозначены методики, разработанные, модифици­рованные или дополненные автором.