Источником чистой культуры дрожжей могут быть лабораторные коллекционные культуры, производ­ственные субстраты и естественные экологические ниши.

Чистой микробной культурой называют популяцию, представляющую собой потом­ство одной или нескольких клеток одного вида микроорганизма.

Каждый новый изолят носит название штамма, ко­торому присваивают буквенное или номерное обозна­чение.

Расами называют производственные штаммы одного вида дрожжей, различающиеся между собой по степени проявления физиологической активности.

В генетических исследованиях пользуются так назы­ваемыми клонами – чистыми культурами, полученными от одной споры или гаплоидной клетки.

Основной задачей при исследовании любого материа­ла является получение чистой культуры, т. е. изолирован­ных колоний тех организмов, которые находятся в суб­страте. При этом важнейшим условием успешной работы является правильный выбор последовательности ее выпол­нения и подбор необходимых питательных сред.

Существуют прямые и непрямые методы получения чистых культур дрожжей.

Первые основаны на выделении одной клетки или спо­ры под непосредственным контролем через микроскоп.

Во втором случае используют косвенные приемы для разделения клеток.

8.1. ПРЯМЫЕ МЕТОДЫ

8.1.1. КАПЕЛЬНЫЙ СПОСОБ ЛИНДНЕРА

Суспензию дрожжей разбавляют жидким суслом до концентрации ≈100 клеток в 1 мл и стерильным чертеж­ным пером наносят мельчайшие капельки на необезжиренное покров­ное стекло, простерилизованное фламбированием в пламени горелки. Капельки распо­лагают в опреде­ленном порядке, обычно по 5 капель в два ряда, т. е. всего 10 капель на стекле. Затем быстро опрокидывают стекло над влажной камерой, которую запечатывают минераль­ной смазкой. Все капли немедленно просматривают под микроскопом и отмечают те из них, которые содержат по одной-единственной клетке. Если все капли содержат по несколько клеток, то увеличивают разбавление суспензии и процедуру повторяют. После трех-, четырехдневного ин­кубирования, когда отмеченные единичные клетки обра­зуют микроколонии, последние переносят стерильной иг­лой или полоской стерильной фильтровальной бумагой в жидкую среду и инкубируют.

8.1.2. МЕТОД ЛИНДНЕРА, УПРОЩЕННЫЙ ВУЧКОВИЧЕМ

Видоизменение Вучковичем метода Линднера сводится к тому, что капельки суспензии, содержащие 3–4 клетки дрожжей, снимают петлей, которой предварительно захва­тывают стерильную среду, и переносят штрихом на поверх­ность плотной среды. Через некоторое время появляются микроколонии, число которых на одном штрихе должно соответствовать количеству исходных клеток в отмеченной капельке. Из этих колоний пересевом выделяют чистые культуры. Таким способом можно сразу получить несколь­ко одноклеточных культур за короткое время.

8.1.3.   ВЫДЕЛЕНИЕ СПОР ДРОЖЖЕЙ ПРИ ПОМОЩИ МИКРОМАНИПУЛЯТОРА

К использованию микроманипулятора прибегают глав­ным образом при необходимости изолировать споры из асков, так как вегетативные клетки легко повреждаются при микроманипулировании. Аски разрывают либо меха­ническим прикосновением игл микроманипулятора, либо заранее обрабатывая суспензию препаратом ферментов (на­пример, из пищеварительного тракта виноградной улитки Helix pomatia), лизирующих клеточную стенку дрожжей.

8.2. НЕПРЯМЫЕ МЕТОДЫ

В эту группу включают методы, основанные на разделении клеток в питательных средах и использовании специфических биологических особенностей отдельных ви­дов для создания преимущественных условий для их роста.

Основным методом выделения чистых культур мик­роорганизмов является метод, предложенный Р. Кохом. Принцип его заключается в получении чистой культуры из изолированной колонии.

На поверхность плотных питательных сред из пипет­ки наносят каплю накопительной культуры или ее разве­дения в стерильной воде и стерильным стеклянным шпа­телем Дригальского распределяют каплю по поверхности среды в чашке Петри (рис. 20). Далее этим же шпателем протирают поверхность среды последовательно во второй, третьей и четвертой чашках. Обычно в первых двух чашках после инкубации наблюдается сплошной рост микроорга­низмов, тогда как в последующих – рост изолированных колоний.

Рассевать накопительную культуру можно бактерио­логической петлей методом истощающего штриха. В этом случае накопительную культуру или ее разведение отби­рают петлей и на поверхности плотной среды проводят штрихи в порядке, указанном на рисунке 21. Перед взя­тием каждого нового инокулята петлю стерилизуют над пламенем горелки.

Рис. 20

Рассев культуры микроорганизмов на поверхность плотной питательной
среды шпателем Дригальского:

а – шпатель Дригальского; б – рассев; в – рост микроорганизмов.

Рис. 21

Рассев культуры микроорганизмов на поверхность плотной питательной среды бактериологической петлей:

1–6 – последовательность контакта бактериологической петли с
поверхностью плотной пита­тельной среды.

После посева чашки Петри помещают в термостат крышками вниз, чтобы конденсационная вода, образо­вавшаяся на крышке чашки при застывании агара и впо­следствии при инкубации, не стекала на поверхность сре­ды и не помешала получить изолированные колонии. Чаш­ки выдерживают в термостате в течение 7­–10 суток при температуре 28–30°С.

С целью сохранения культуры выросшие изолирован­ные колонии отсевают петлей на поверхность скошенного 2,5%-ного сусло-агара в пробирки или в жидкое неохмеленное сусло (8% СВ).

Посев на скошенный агар производится бактериоло­гической петлей методом истоща­ющего штриха, начиная со дна пробирки.

Длительное хранение требует особого подбора среды и условий хранения биомассы, при которых культура сохра­нит свою физиологическую активность.

В зависимости от первичного источника выделения и интенсивности его обсеменения следует принимать реше­ние об использовании накопительных (элективных) сред на стадии посевов первичного материала.

Внесение в питательные среды селективных компо­нентов, их качественный и коли­чественный состав опре­деляются интенсивностью и биологическим разнообрази­ем обсе­менения первоначального субстрата посторонней сопутствующей плесневой, дрожжевой и бактериальной микрофлорой. При выделении дрожжей из сильно загряз­ненных суб­стратов и подавления роста сопутствующих мик­роорганизмов к указанным выше питательным средам до­бавляют различные ингибиторы селективного действия.

Рост большинства бактерий и актиномицетов подав­ляется при низком значении рН среды, поэтому чаще все­го среды для выделения дрожжей подкисляют до рН 4,5 путем добавления к ним минеральных или органических кислот. Для синтетических сред наи­более применима со­ляная кислота, для сусловых – молочная, лимонная или винная. Для подкисления солодового сусла (8% СВ) обыч­но требуется концентрированной молочной кислоты 3–4 см³/л. Кислоты добавляют в жидкую или расплавлен­ную агаровую среду после стерилизации, непосредствен­но перед засевом или перед разливкой в чашки Петри.

Вместо кислот используют также антибиотики широко­го спектра действия: стрептомицин (80 мг/л или 100 ед/см³), пенициллин (20–100 ед/см³), левомицетин (50 мг/л) и др. Их можно добавлять в среду порознь и в комплексе. На­пример, против кислотоустойчивых бактерий применяют следующие смеси антибиотиков: пенициллин 60 ед/см³ + стрептомицина сульфат 100 ед/см³; левомицетин (хлорамфеникол) 20 мг/л + стреп­то­мицина сульфат 20 мг/л + хлортетрациклин солянокислый 100 мг/л.

Для отделения сахаромицетов от других дрожжей до­бавляют 2,5% этилацетата и рН до 4,0 доводят уксусной кислотой. Затем чашки герметизируют. При этих услови­ях колонии сахаромицетов появляются первыми.

Росту дрожжей на питательных средах при высеве из исходного материала зачастую препятствуют грибы с широко распространяющимися по поверхности субстрата мицели­альными колониями. Они имеют общие с дрожжами потребности в источниках питания, устойчивы к низким значениям рН среды и нечувствительны к действию ука­занных выше противобактериальных антибиотиков. Для ограничения роста микромицетов в среду добавляют спе­цифические вещества: дифенил (0,005–0,01%), бычью желчь (0,25–0,5%), теллурат калия (0,05–0,15% ), пропионат натрия (0,15–0,25%), или некоторые красители: бромкрезоловый пурпурный (0,0025% или 2,5 см³/л 1% рас­твора), бенгальский розовый (0,003%), кристаллический фиолетовый (0,001%).

Поскольку дрожжи являются факультативными ана­эробами и не требуют особых условий аэрирования, для получения их изолированных колоний посевы из накопи­тельной культуры или другого исследуемого материала лучше производить на поверхность 2,5%-ного сусло-ага­ра и инкубировать в обычных условиях при 28–30°С.