Пробу исследуемой культуры дрожжей высевают в чашку Петри на сусло-агар. Через 6–7 суток выращивания дрожжей в термостате при 30°С из наиболее крупных колоний делают пересевы на косой сусло-агар и одновременный посев одной петли в пробирку с 15 см3 солодового сусла.
Пробирки с посевом ставят в термостат с температурой 30°С. Через 42–48 ч сусло осторожно сливают с дрожжевого осадка.
В маленькие пробирки (длина 12 см, диаметр 1,2 см), одинаковые по диаметру, насыпают по 1 г муки, употребляемой для обычной проверки подъемной силы дрожжей.
В пробирки с дрожжевым осадком наливают по 2 см3 нагретой до 30°С водопроводной воды, осадок тщательно взбалтывают в воде петлей диаметром 0,9 см, изготовленной из толстой проволоки, затем дрожжевую суспензию выливают в пробирку с мукой и размешивают до равномерной консистенции. Верхний уровень этой мучной болтушки отмечают восковым карандашом, все пробирки ставят в термостат при 30°С.
Через каждые 15 мин вынимают пробирки, быстро отмечают новый уровень подъема жидкого теста и обычной линейкой замеряют высоту подъема от первой отметки до второй.
Наблюдение длится 60 мин.
Предлагаемую в качестве примера таблицу 9 можно использовать для регистрации полученных результатов.
Таблица 9
Активность исследуемой культуры
Если дрожжи из отмеченной по лучшему подъему колонии имеют также лучшие показатели по микроскопии (клетки однородные, примеси посторонних микроорганизмов нет), то эту пробирку с колониями на косом сусло-агаре используют для посевов при выпуске следующей генерации чистой культуры дрожжей.
9.2. МОДИФИЦИРОВАННЫЙ МЕТОД ОТБОРА НАИБОЛЕЕ АКТИВНОЙ КУЛЬТУРЫ***
Производственную или коллекционную культуру дрожжей высевают на чашку Петри с 2,5%-ным сусло-агаром и инкубируют при 30°С в течение 72–96 ч. По окончании инкубации выбирают 3–5 наиболее крупных колоний, характер роста и морфология клеток которых соответствуют исследуемой расе. Из каждой колонии одновременно делают пересевы на скошенный сусло-агар и в колбу с 50 см3 солодового сусла плотностью 8% СВ. Оба посева инкубируют при 30°С в течение 72 ч. Культуру на скошенном агаре хранят до окончания эксперимента при 2–4°С, а культуру на сусле используют для проведения анализа.
В заранее взвешенные с точностью до 0,01 г градуированные центрифужные пробирки разливают по 10 см3 тщательно перемешанной жидкой культуры дрожжей. Центрифугируют 15 мин при частоте вращения 2000 об/мин, после чего сливают надосадочную жидкость и снова взвешивают пробирку с осажденной дрожжевой биомассой. По разнице второго и первого взвешиваний определяют массу осажденных дрожжей в каждой пробирке. Для дальнейшей работы отбирают две из них с наибольшим количеством биомассы с целью постановки параллельных проб. Исходя из полученных результатов, рассчитывают количество необходимых ингредиентов – муки пшеничной 1-го сорта и воды.
Полученная масса отпрессованных в центрифуге дрожжей должна составить 2% к массе используемой в эксперименте муки и 1% к объему воды, т. е. на каждые 0,01 г дрожжей вносят 0,5 г муки 1-го сорта и 1 см3 воды.
Далее в градуированную пробирку объемом 25 мл вносят необходимое количество муки.
В центрифужную пробирку с осажденными дрожжами добавляют необходимое количество воды и тщательно перемешивают до однородной суспензии, которую сразу переносят в пробирку с мукой.
Петлей из толстой проволоки смесь перемешивают до получения равномерной мучной болтушки, после чего регистрируют ее первоначальный объем.
Полученные таким образом пробы помещают в термостат при 30°С. Наблюдение ведут в течение 90 мин, при этом каждые 15 мин регистрируют уровень подъема жидкого теста.
По окончании инкубирования рассчитывают отношение объема жидкого теста на каждый момент регистрации к его первоначальному объему. Среднее арифметическое между полученными результатами считают показателем активности выбранной культуры.
Такой метод учета результатов позволяет проследить динамику подъема жидкого теста, которая может различаться у культур при одинаковом объеме теста на конец опыта.
Лучшей считается проба с наибольшей средней величиной шести зарегистрированных показателей подъема теста, а культура, используемая для этой пробы, – наиболее активной.
9.3. ВЫБОР НАИБОЛЕЕ АКТИВНОЙ КУЛЬТУРЫ МАНОМЕТРИЧЕСКИМ МЕТОДОМ***
Для проведения анализа необходимо собрать несложный прибор, состоящий из бродильного сосуда (100–120 см3), медицинского анероидного манометра и газоотводной трубки с краником (рис. 22). Перед началом работы следует точно измерить внутренний объем прибора V1, величина которого в дальнейшем будет использоваться как постоянная.
Производственную или коллекционную культуру дрожжей пересеять на чашку Петри с 2,5%-ным сусло-агаром и инкубировать при 30°С в течение 96–120 ч. По окончании инкубации выбрать 3 наиболее крупные колонии, характер роста и морфология клеток которых соответствуют исследуемой расе.
Каждую из выбранных колоний рассеять на скошенный агар и в две чашки Петри, при этом на поверхность агара в чашках перенести большую часть колонии для получения в них сплошного роста.
Все посевы инкубировать при 30°С в течение 120–140 ч.
Культуру на скошенном агаре хранить до окончания эксперимента при 2–4°С. Дрожжевую биомассу, полученную в чашках Петри, использовать для анализа.
Полученный в чашках сплошной слой дрожжей снять с поверхности агара шпателем и отвесить 0,5 г. Биомассу перенести в 10 см3 физиологического раствора температурой 30°С и размешать до получения однородной суспензии, которую сразу перелить в бродильный сосуд. Туда же добавить 10 см3 8–10%-ного солодового сусла и герметично закрыть резиновой пробкой с газоотводной трубкой. Свободный конец трубки соединить гибким шлангом с манометром. Для уравнивания давления в сосуде с атмосферным давлением извлечь подвижную часть краника и сразу вернуть его на место, тщательно притерев и совместив отверстия.
Рис. 22
Схема прибора для проведения анализа:
/ – колба; 2 – резиновая пробка; 3 – газоотводная трубка; 4 – краник; 5 – подвижная часть; 6 – манометр; 7 – дрожжевая суспензия.
Подготовленный таким образом прибор поместить в термостат при 30°С (303 К) и регистрировать время, за которое стрелка манометра достигнет необходимой отметки, соответствующей 10 см3 выделенного углекислого газа.
Соответствующее этим условиям показание манометра рассчитать по формуле
где Рх – показание манометра; т = 0,016; R = 62 360 мм рт. ст./моль·К; Т = 303 К; М = 44 г; Vx = V1 – 20,5 см3 (объем суспензии).
Подставив значения в формулу, определить давление, создаваемое газом массой 0,016 г и объемом 10 см3 в используемом объеме Vx при температуре Т.
Время, за которое стрелка манометра достигнет определенной по формуле величины, считать показателем активности.
Лучшей считать культуру, затратившую минимальное время на выделение 10 мл углекислого газа, а значит, обладающую более высокой ферментативной активностью.
Окончательное решение принимать только с учетом культуральных и морфологических свойств исследуемой культуры.
Хранившуюся на скошенном агаре дублирующую культуру, показавшую лучшие результаты, использовать для разводочного цикла.