9.1. СТАНДАРТНЫЙ МЕТОД

Пробу исследуемой культуры дрожжей высе­вают в чашку Петри на сусло-агар. Через 6–7 суток выра­щивания дрожжей в термостате при 30°С из наиболее крупных колоний делают пересевы на косой сусло-агар и одновременный посев одной петли в пробирку с 15 см³ со­лодового сусла.

Пробирки с посевом ставят в термостат с температу­рой 30°С. Через 42–48 ч сусло осторожно сливают с дрож­жевого осадка.

В маленькие пробирки (длина 12 см, диаметр 1,2 см), одинаковые по диаметру, насы­па­ют по 1 г муки, употреб­ляемой для обычной проверки подъемной силы дрожжей.

В пробирки с дрожжевым осадком наливают по 2 см³ нагретой до 30°С водопроводной воды, осадок тщательно взбалтывают в воде петлей диаметром 0,9 см, изготовлен­ной из толстой проволоки, затем дрожжевую суспензию выливают в пробирку с мукой и разме­шивают до равно­мерной консистенции. Верхний уровень этой мучной бол­тушки отме­чают восковым карандашом, все пробирки ста­вят в термостат при 30°С.

Через каждые 15 мин вынимают пробирки, быстро от­мечают новый уровень подъема жидкого теста и обычной линейкой замеряют высоту подъема от первой отметки до второй.

Наблюдение длится 60 мин.

Предлагаемую в качестве примера таблицу 9 можно использовать для регистрации полученных результатов.

Таблица 9

Активность исследуемой культуры

Если дрожжи из отмеченной по лучшему подъему ко­лонии имеют также лучшие показатели по микроскопии (клетки однородные, примеси посторонних микроорганиз­мов нет), то эту пробирку с колониями на косом сусло-агаре используют для посевов при выпуске следующей ге­нерации чистой культуры дрожжей.

9.2. МОДИФИЦИРОВАННЫЙ МЕТОД ОТБОРА НАИБОЛЕЕ АКТИВНОЙ КУЛЬТУРЫ^***

Производственную или коллекционную куль­туру дрожжей высевают на чашку Петри с 2,5%-ным сус­ло-агаром и инкубируют при 30°С в течение 72–96 ч. По окончании инку­бации выбирают 3–5 наиболее крупных колоний, характер роста и морфология клеток которых соответствуют исследуемой расе. Из каждой колонии од­новременно делают пересевы на скошенный сусло-агар и в колбу с 50 см³ солодового сусла плотностью 8% СВ. Оба посева инкубируют при 30°С в течение 72 ч. Культуру на скошенном агаре хранят до окончания эксперимента при 2–4°С, а культуру на сусле используют для прове­дения анализа.

В заранее взвешенные с точностью до 0,01 г градуи­рованные центрифужные пробирки разливают по 10 см³ тщательно перемешанной жидкой культуры дрожжей. Центри­фуги­руют 15 мин при частоте вращения 2000 об/мин, после чего сливают надосадочную жидкость и снова взвешивают пробирку с осажденной дрожжевой биомассой. По разнице второго и первого взвешиваний определяют массу осажденных дрожжей в каждой про­бирке. Для даль­нейшей работы отбирают две из них с наибольшим коли­чеством биомассы с целью постановки параллельных проб. Исходя из полученных результатов, рассчи­тывают коли­чество необходимых ингредиентов – муки пшеничной 1-го сорта и воды.

Полученная масса отпрессованных в центрифуге дрож­жей должна составить 2% к массе используемой в экспе­рименте муки и 1% к объему воды, т. е. на каждые 0,01 г дрожжей вносят 0,5 г муки 1-го сорта и 1 см³ воды.

Далее в градуированную пробирку объемом 25 мл вно­сят необходимое количество муки.

В центрифужную пробирку с осажденными дрожжа­ми добавляют необходимое коли­чество воды и тщательно перемешивают до однородной суспензии, которую сразу пере­носят в пробирку с мукой.

Петлей из толстой проволоки смесь перемешивают до получения равномерной мучной болтушки, после чего ре­гистрируют ее первоначальный объем.

Полученные таким образом пробы помещают в термо­стат при 30°С. Наблюдение ведут в течение 90 мин, при этом каждые 15 мин регистрируют уровень подъема жид­кого теста.

По окончании инкубирования рассчитывают отноше­ние объема жидкого теста на каждый момент регистра­ции к его первоначальному объему. Среднее арифметиче­ское между полученными результатами считают показа­телем активности выбранной культуры.

Такой метод учета результатов позволяет проследить динамику подъема жидкого теста, которая может разли­чаться у культур при одинаковом объеме теста на конец опыта.

Лучшей считается проба с наибольшей средней вели­чиной шести зарегистрированных показателей подъема теста, а культура, используемая для этой пробы, – наи­более активной.

9.3. ВЫБОР НАИБОЛЕЕ АКТИВНОЙ КУЛЬТУРЫ МАНОМЕТРИЧЕСКИМ МЕТОДОМ^***

Для проведения анализа необходимо собрать несложный прибор, состоящий из бродильного сосуда (100–120 см³), медицинского анероидного манометра и газоотводной трубки с краником (рис. 22). Перед началом работы следует точно измерить внутренний объем прибо­ра V₁, величина которого в дальнейшем будет использо­ваться как постоянная.

Производственную или коллекционную культуру дрож­жей пересеять на чашку Петри с 2,5%-ным сусло-агаром и инкубировать при 30°С в течение 96–120 ч. По оконча­нии инкубации выбрать 3 наиболее крупные колонии, ха­рактер роста и морфология клеток которых соответству­ют исследуемой расе.

Каждую из выбранных колоний рассеять на скошен­ный агар и в две чашки Петри, при этом на поверхность агара в чашках перенести большую часть колонии для по­лучения в них сплошного роста.

Все посевы инкубировать при 30°С в течение 120–140 ч.

Культуру на скошенном агаре хранить до окончания эксперимента при 2–4°С. Дрож­же­вую биомассу, получен­ную в чашках Петри, использовать для анализа.

Полученный в чашках сплошной слой дрожжей снять с поверхности агара шпателем и отвесить 0,5 г. Биомассу перенести в 10 см³ физиологического раствора температурой 30°С и размешать до получения однородной суспен­зии, которую сразу перелить в бродильный сосуд. Туда же добавить 10 см³ 8–10%-ного солодового сусла и герметич­но закрыть резиновой пробкой с газоотводной трубкой. Свободный конец трубки соединить гибким шлангом с манометром. Для уравнивания давления в сосуде с атмо­сферным давлением извлечь подвижную часть краника и сразу вернуть его на место, тщательно притерев и совмес­тив отверстия.

Рис. 22

Схема прибора для проведения анализа:

/ – колба; 2 – резиновая проб­ка; 3 – газоотводная трубка; 4 – краник; 5 – подвижная часть; 6 – мано­метр; 7 – дрож­жевая суспензия.

Подготовленный таким образом прибор поместить в тер­мостат при 30°С (303 К) и регистрировать время, за кото­рое стрелка манометра достигнет необходимой отметки, соответствующей 10 см³ выделенного углекислого газа.

Соответствующее этим условиям показание маномет­ра рассчитать по формуле

где Р_х – показание манометра; т = 0,016; R = 62 360 мм рт. ст./моль·К; Т = 303 К; М = 44 г; V_x = V₁ – 20,5 см³ (объ­ем суспензии).

Подставив значения в формулу, определить давление, создаваемое газом массой 0,016 г и объемом 10 см³ в ис­пользуемом объеме V_x при температуре Т.

Время, за которое стрелка манометра достигнет опре­деленной по формуле величины, считать показателем ак­тивности.

Лучшей считать культуру, затратившую минимальное время на выделение 10 мл углекислого газа, а значит, об­ладающую более высокой ферментативной активностью.

Окончательное решение принимать только с учетом культуральных и морфо­ло­ги­ческих свойств исследуемой культуры.

Хранившуюся на скошенном агаре дублирующую куль­туру, показавшую лучшие результаты, использовать для разводочного цикла.