Наиболее простым для проверки жизнеспособности дрожжевых клеток в суспензии является метод с использованием метиленового синего. Этот метод обусловлен тем, что метиленовый синий благодаря дыхательной активности клеток быстро редуцируется и теряет окраску. При отмирании клетки становятся более проницаемы для метиленового синего, и при отсутствии дыхательной активности цвет остается синим. Таким образом, метиленовый синий указывает на отсутствие у клеток дыхательного метаболизма, а не на их гибель как таковую, причем существует возможность, что некоторые метаболически активные клетки оказываются не способными к размножению, в связи с чем они будут отнесены к мертвым.
Если число жизнеспособных клеток превышает 90%, этим можно пренебречь, но при снижении числа таких клеток менее чем до 90% эта погрешность становится все более значимой. Общее количество клеток в 1 см3 и количество «синих» клеток измеряется в камере для подсчета. Для измерения процента жизнеспособных клеток с точностью 0,5% необходимо насчитать не менее 200 клеток. Для получения большей точности необходимо наличие не менее 600 клеток, причем не менее чем в двух отдельных пробах. Использовать два раздельных анализа следует потому, что среднее из двух результатов обеспечит большую точность результатов.
Другие красители дают лучшие результаты, например метиленовый фиолетовый.
Как бы то ни было, в настоящее время общепризнано, что информация о проценте жизнеспособных клеток не позволяет гарантировать приемлемое состояние засевных дрожжей. Термин «жизнеспособность» отражает способность дрожжей к быстрому и эффективному сбраживанию, а не состояние «быть живым».
10.1. ЖИЗНЕСПОСОБНОСТЬ ДРОЖЖЕЙ ПО СТЕПЕНИ ОКИСЛЕНИЯ
В качестве индикаторов жизнеспособности предложены самые разные методы, включая содержание гликогена, АТФ или стерола, образование СО2 или потребление О2 из раствора глюкозы, а также скорость выделения определенных ионов.
Наиболее удобным методом для определений, которые должны быть выполнены в кратчайшее время, является выделение ионов Н+, т. е. снижение значения величины рН, при введении дрожжей в сбраживаемый субстрат.
Для определения жизнеспособности дрожжей по степени окисления дрожжи промывают центрифугированием и затем тщательно перемешивают в 100 см3 дистиллированной воды. Через 10 мин добавляют 5 см3 20%-ного (масс/об) раствора глюкозы и перемешивают еще 10 мин. В ходе инкубации в течение 20 мин каждую минуту измеряют рН суспензии. Резкое снижение значения рН сразу же и после добавления раствора глюкозы до < 4 свидетельствует об активности дрожжей, а степень окисления коррелирует с изменением величины рН.
Как и метод с использованием метиленового синего, данный метод достаточно быстр и позволяет получить результаты до внесения дрожжей.
10.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА МЕРТВЫХ КЛЕТОК
10.2.1. ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЕ ОКРАШИВАНИЕ МЕТИЛЕНОВЫМ СИНИМ
Около 1 г сушеных дрожжей вносят в пробирку со стерильным солодовым суслом плотностью 8% видимых СВ.
Пробирку ставят в термостат при температуре 30°С на 4 ч. За это время все живые клетки, содержащиеся в пробе, выходят из состояния анабиоза и начинают почковаться. Из подмоложенных таким способом дрожжей готовят препарат, который окрашивают метиленовый синим, приготовленным на буферной смеси.
Для прессованных дрожжей и живой культуры нет необходимости в такой процедуре.
Каплю взвеси дрожжей смешивают с каплей синьки на предметном стекле и накрывают покровным стеклом. Мертвые клетки окрашиваются, а живые остаются неокрашенными. В пяти полях зрения отдельно подсчитывают количество мертвых и живых клеток, процент мертвых клеток вычисляют по отношению ко всему количеству клеток. Материнскую клетку с неотделившейся почкой принимают за одну клетку.
Используют люминесцентный микроскоп или люминесцентный осветитель и флуорохром примулин.
Краситель готовят в виде двух растворов: водный раствор (1:20 000) и раствор (1:20 000) в фосфатном буфере рН 8–9. Оба раствора хранят в темноте.
Предметные и покровные стекла тщательно обезжирены.
При микроскопировании белых вин бактериологической петлей помещают на предметное стекло каплю осадка и рядом каплю водного раствора примулина, смешивают их и накрывают покровным стеклом, на которое затем наносят каплю нелюминесцирующего иммерсионного масла.
При микроскопировании красных вин (в связи с гашением люминесценции) красный цвет необходимо устранить, что достигается созданием в препарате щелочной среды. Красный цвет вина при этом превращается в синий.
Бактериологической петлей помещают на предметное стекло каплю осадка вина и две капли раствора примулина в фосфатном буферном растворе рН 8–9. Капли тщательно смешивают петлей в течение 1–2 мин, затем накрывают покровным стеклом, на которое помещают каплю нелюминесцирующего иммерсионного масла.
Приготовленные препараты рассматривают в люминесцентном микроскопе в фиолетовой и синей видимой частях спектра. Для этого пользуются светофильтрами: синим, сине-зеленым, белым и запирающим желтым.
Сначала препарат рассматривают в проходящем свете и подсчитывают общее количество микроорганизмов, а затем – в свете люминесценции, подсчитывая только количество мертвых клеток.
В свете люминесценции живые микроорганизмы не видны, иногда у дрожжевых клеток светится только оболочка в виде тонкого зеленого кольца. Мертвые дрожжи и бактерии в свете люминесценции светятся зеленым и желтым светом разной интенсивности.
При подсчете микроорганизмов необходимо учитывать разведение исследуемого материала в 2 раза для белых вин и в 3 раза – для красных.
10.2.3. МЕТОД ЭПИФЛУОРЕСЦЕНЦИИ
Методика позволяет определять количество жизнеспособных клеток дрожжей в винах и других сброженных материалах, содержащих их небольшое количество (в момент розлива в бутылки), с использованием эпифлуоресценции, и сравнивается с контрольным методом (подсчет колоний на питательной среде).
Применяют также красители-флуорохромы и люминесцентный микроскоп.
Препарат готовят на мембранах Миллипор из поликарбоната диаметром 13–25 мм или из ацетилцеллюлозы диаметром 45 мм.
Испытуемое вино фильтруют под вакуумом через мембраны, окрашивают и подсчитывают под микроскопом число клеток в см3 с учетом числа клеток и подсчитанных полей, площади фильтрующей мембраны, площади полей микроскопа, объема отфильтрованного образца, числа наблюдаемых полей.
