униконсы

Группа компаний "Униконс"

Продвижение и реализация пищевых добавок, антисептиков и другой продукции НПО Альтернатива.

Перейти на сайт
септоцилы

"Антисептики Септоцил"

Септоцил. Бытовая химия

Септоцил - ваш выбор в борьбе за чистоту

Перейти на сайт
петритесты

"Петритест"

Микробиологические экспресс-тесты. Первые результаты уже через 4 часа.

Перейти на сайт

Наиболее простым для проверки жизнеспособ­ности дрожжевых клеток в суспензии является метод с использованием метиленового синего. Этот метод обуслов­лен тем, что метиленовый синий благодаря дыхательной активности клеток быстро редуцируется и теряет окраску. При отмирании клетки становятся более прони­цаемы для метиленового синего, и при отсутствии дыхательной ак­тивности цвет остается синим. Таким образом, метилено­вый синий указывает на отсутствие у клеток дыхательно­го метаболизма, а не на их гибель как таковую, причем существует возмож­ность, что некоторые метаболически активные клетки оказываются не способными к размно­жению, в связи с чем они будут отнесены к мертвым.

Если число жизнеспособных клеток превышает 90%, этим можно пренебречь, но при снижении числа таких клеток менее чем до 90% эта погрешность становится все более значимой. Общее количество клеток в 1 см3 и коли­чество «синих» клеток измеряется в камере для подсчета. Для измерения процента жизнеспособных клеток с точ­ностью 0,5% необходимо насчитать не менее 200 клеток. Для получения большей точности необходимо наличие не менее 600 клеток, причем не менее чем в двух отдельных пробах. Исполь­зовать два раздельных анализа следует потому, что среднее из двух результатов обеспечит боль­шую точность результатов.

Другие красители дают лучшие результаты, например метиленовый фиолетовый.

Как бы то ни было, в настоящее время общепризнано, что информация о проценте жизнеспособных клеток не позволяет гарантировать приемлемое состояние засевных дрожжей. Термин «жизнеспособность» отражает способ­ность дрожжей к быстрому и эффективному сбраживанию, а не состояние «быть живым».

 

10.1. ЖИЗНЕСПОСОБНОСТЬ ДРОЖЖЕЙ ПО СТЕПЕНИ ОКИСЛЕНИЯ

В качестве индикаторов жизнеспособности пред­ложены самые разные методы, вклю­чая содержание гли­когена, АТФ или стерола, образование СО2 или потребле­ние О2 из раствора глюкозы, а также скорость выделения определенных ионов.

Наиболее удобным методом для определений, которые должны быть выполнены в кратчайшее время, является выделение ионов Н+, т. е. снижение значения величины рН, при введении дрожжей в сбраживаемый субстрат.

Для определения жизнеспособности дрожжей по сте­пени окисления дрожжи промывают центрифугировани­ем и затем тщательно перемешивают в 100 см3 дистилли­рованной воды. Через 10 мин добавляют 5 см3 20%-ного (масс/об) раствора глюкозы и перемешивают еще 10 мин. В ходе инкубации в течение 20 мин каждую минуту изме­ряют рН суспензии. Резкое снижение значения рН сразу же и после добавления раствора глюкозы до 4 свидетель­ствует об активности дрожжей, а степень окисления кор­рели­рует с изменением величины рН.

Как и метод с использованием метиленового синего, данный метод достаточно быстр и позволяет получить ре­зультаты до внесения дрожжей.

10.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА МЕРТВЫХ КЛЕТОК

10.2.1. ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЕ ОКРАШИВАНИЕ МЕТИЛЕНОВЫМ СИНИМ

Около 1 г сушеных дрожжей вносят в пробир­ку со стерильным солодовым суслом плот­ностью 8% ви­димых СВ.

Пробирку ставят в термостат при температуре 30°С на 4 ч. За это время все живые клетки, содержащиеся в пробе, выходят из состояния анабиоза и начинают почковаться. Из подмоложенных таким способом дрожжей готовят пре­парат, который окрашивают метиленовый синим, приго­товленным на буферной смеси.

Для прессованных дрожжей и живой культуры нет необходимости в такой процедуре.

Каплю взвеси дрожжей смешивают с каплей синьки на предметном стекле и накрывают покровным стеклом. Мертвые клетки окрашиваются, а живые остаются неок­рашенными. В пяти полях зрения отдельно подсчитыва­ют количество мертвых и живых клеток, процент мерт­вых клеток вычисляют по отношению ко всему количест­ву клеток. Материнскую клетку с неотделившейся почкой принимают за одну клетку.

 

10.2.2. ЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЙ МЕТОД

Используют люминесцентный микроскоп или люми­несцентный осветитель и флуоро­хром примулин.

Краситель готовят в виде двух растворов: водный рас­твор (1:20 000) и раствор (1:20 000) в фосфатном буфере рН 8–9. Оба раствора хранят в темноте.

Предметные и покровные стекла тщательно обезжи­рены.

При микроскопировании белых вин бактериологиче­ской петлей помещают на предмет­ное стекло каплю осадка и рядом каплю водного раствора примулина, смешивают их и накрывают покровным стеклом, на которое затем на­носят каплю нелюминесцирующего иммерсионного масла.

При микроскопировании красных вин (в связи с га­шением люминесценции) красный цвет необходимо уст­ранить, что достигается созданием в препарате щелоч­ной среды. Красный цвет вина при этом превращается в синий.

Бактериологической петлей помещают на предметное стекло каплю осадка вина и две капли раствора примули­на в фосфатном буферном растворе рН 8–9. Капли тща­тельно смешивают петлей в течение 1–2 мин, затем накры­вают покровным стеклом, на которое помещают каплю нелюминесцирующего иммерсионного масла.

Приготовленные препараты рассматривают в люми­несцентном микроскопе в фиоле­товой и синей видимой частях спектра. Для этого пользуются светофильтрами: синим, сине-зеленым, белым и запирающим желтым.

Сначала препарат рассматривают в проходящем свете и подсчитывают общее коли­чество микроорганизмов, а затем – в свете люминесценции, подсчитывая только ко­личество мертвых клеток.

В свете люминесценции живые микроорганизмы не видны, иногда у дрожжевых клеток светится только обо­лочка в виде тонкого зеленого кольца. Мертвые дрожжи и бактерии в свете люминесценции светятся зеленым и жел­тым светом разной интен­сивности.

При подсчете микроорганизмов необходимо учитывать разведение исследуемого материала в 2 раза для белых вин и в 3 раза – для красных.

 

10.2.3. МЕТОД ЭПИФЛУОРЕСЦЕНЦИИ

Методика позволяет определять количество жизнеспо­собных клеток дрожжей в винах и других сброженных материалах, содержащих их небольшое количество (в мо­мент розлива в бутылки), с использованием эпифлуоресценции, и сравнивается с контрольным методом (подсчет колоний на питательной среде).

Применяют также красители-флуорохромы и люми­несцентный микроскоп.

Препарат готовят на мембранах Миллипор из поликар­боната диаметром 13–25 мм или из ацетилцеллюлозы диа­метром 45 мм.

Испытуемое вино фильтруют под вакуумом через мем­браны, окрашивают и подсчитывают под микроскопом число клеток в см3 с учетом числа клеток и подсчитанных полей, площади фильтрующей мембраны, площади полей микроскопа, объема отфильтрованного образца, числа наблюдаемых полей.

loading...
Связаться с нами+7 (8452) 37-67-02
Связаться по e-mailalternativa-sar@yandex.ru
Наш адрес Саратов, Шелковичная 186, 511 оф.

 

яндекс.ћетрика