О росте микроорганизмов в естественных суб­стратах или в пита­тельных средах судят по изменению количества их клеток или биомассы в единице объема. Методы определения этих показателей могут быть пря­мыми (подсчет клеток под микроскопом, взвешивание) или косвенными. Косвенные методы основаны на изме­рении параметров, величина которых зависит от коли­чества или биомассы микроорганизмов (число колоний, выросших после посева суспензии клеток на питатель­ную среду, рассеяние или поглощение суспензией света, содержание в ней белка и т. д.). Выбор метода зависит от целей исследования, свойств питательной среды или суб­страта, а также особенностей роста и морфологии микро­организмов.

При оценке численности микроорганизмов, особенно в естественных субстратах, не­обхо­димо помнить, что их клетки часто находятся в прикрепленном (адгезированном) состоянии или в виде микроколоний. Поэтому перед началом подсчета их нужно отделить от частиц субстрата и друг от друга (десорбировать). Выбор метода десорбции (меха­ническое перемешивание суспензии клеток, расти­рание, обработка ультразвуком, приме­нение поверхност­но-активных веществ и т. д.) определяется особенностя­ми исследуемого субстрата.

Для подсчета клеток микроорганизмов под микро­скопом можно использовать счетные камеры, препараты фиксированных и окрашенных клеток, приготовленные на предметных стеклах или мембранных фильтрах. Пере­численные методы позволяют определить общее количе­ство клеток (как живых, так и мертвых) в единице объ­ема. Основное ограничение большинства указанных ме­тодов – необходимость довольно высоких концентраций клеток в единице исследуемого субстрата.

В отличие от подсчета микроорганизмов под микро­скопом, метод высева на питательные среды дает возмож­ность определить только число жизнеспособных клеток в популяции.

Поскольку сред, пригодных для роста всех микроор­ганизмов, не существует, метод высева позволяет опреде­лить лишь число микроорганизмов, способных расти на среде данного состава. Это важно помнить при анализе таких естественных субстратов, как почва, вода и т. п.

Метод взвешивания биомассы широко применяют для оценки роста микроорганизмов в жидких питательных средах. Можно использовать его и для определения массы клеток, выращенных на плотной питательной среде, од­нако в этом случае микроорганизмы необходимо предва­рительно тщательно смыть с поверхности среды физиоло­гическим раствором или водой и перевести в суспензию.

Оптический (нефелометрический, турбидиметрический) метод определения био­массы нашел широкое при­менение в лабораторных микробиологических исследо­ваниях, поскольку позволяет быстро и довольно точно определить концентрацию клеток в сус­пензии или культуральной жидкости. В основе метода лежит измерение ослабления светового пучка при его прохождении через суспензию клеток. В определенных пределах оно обуслов­лено преимущественно рассеиванием света клетками про­порционально их концентрации. Величина этого показа­теля зависит от многих факторов (формы и размеров кле­ток, оптических свойств культуральной среды, длины волны света и т. д.), поэтому нефелометрический метод пригоден лишь для тех микроорганизмов, рост которых вызывает равномерное помутнение среды и не сопровож­дается заметным изменением формы и размеров клеток, образованием мицелия, пленок или других скоплений.

Чашечный метод требует особой чистоты и аккурат­ности при выполнении всех операций. Необходимо тща­тельно оберегать пипетки, пробирки и среды от зараже­ния микроорганизмами из воздуха, так как каждая слу­чайно попавшая клетка может заметно завысить число микроорганизмов в исследуемом субстрате.

Точность любого метода определения числа микроор­ганизмов ограничена ошибкой метода, которая возникает вследствие случайного распределения клеток в суспензии и является результатом ограниченного числа подсчитывае­мых клеток, а также связана с техническими ошибками, т. е. неточностью в приготовлении разведений, неправиль­ным монтажом камеры, повторным учетом одной и той же клетки (колонии) и т. д. Ошибки метода неизбежны, то­гда как технические ошибки зависят главным образом от качества работы исследователя. Следует помнить, что ста­тистическая обработка результатов возможна только при минимальной технической ошибке.

Этот метод рекомендуется использовать для под­счета крупных объектов – дрожжей, одноклеточных во­дорослей, конидий грибов, некоторых относительно круп­ных бактерий. Наиболее распространенной является ка­мера Горяева–Тома (рис. 23). Внешне она пред­став­ляет собой толстое предметное стекло, разделенное бороздка­ми. Центральная часть стекла содержит выемку глубиной 0,1 мм, на дно которой нанесена сетка. Глубина камеры – 0,1 мм, площадь больших квадратов сетки – 1/25 мм², площадь малых квадратов – 1/400 мм². Эти параметры указаны на предметном стекле.

При работе с камерой необходимо соблюдать опреде­ленные правила ее заполнения. Углубление с сеткой по­крывают специальным шлифованным покровным стек­лом и, слегка прижимая, двигают покровное стекло в противоположные стороны до появления картины интерференции (колец Ньютона), свидетельствующей о том, что стекло притерто к сторонам ка­меры. Только при таком усло­вии объем камеры соответству­ет расчетному. После этого под кромку покровного стекла в цен­тральной части камеры капил­ляром или пипеткой вносят сус­пензию исследу­емых дрожжей. Заполненную камеру помещают на столик микроскопа. Подсчет клеток рекомендуется начинать через 2–3 мин после запол­нения камеры, чтобы клетки осели, и при микроскопировании нахо­дились в одной плоскости.

Число клеток подсчитыва­ют с объективом 40×. С иммер­сионным объективом работать нельзя, так как его рабочее рас­стояние меньше толщины стек­ла камеры.

Рис. 23

Счетная камера Горяева-Тома:

1 – вид сбоку; 2 – вид сверху;
3 – при малом увеличении мик­ро­скопа; h – глубина камеры.

Обычно просчитывают клетки микроорганизмов в 10 больших или 20 малых квадратах сетки, следуя по диагонали. Учитывают все клетки, лежащие в квадрате сетки, а также пересекающие верхнюю и правую стороны квадрата. При подсчете число клеток в большом квадрате не должно превышать 20, а в малом – 10, в противном случае исходную суспензию разводят водопроводной во­дой. Для получения достоверного результата общее число подсчитанных клеток микроорганизмов должно быть не менее 600.

Подсчет клеток повторяют 3–5 раз, каждый раз зано­во монтируя камеру и заполняя ее суспензией микроорга­низмов. Это обеспечивает большую точность, чем подсчет 600 клеток при однократном монтаже камеры. Количест­во клеток в 1 см³ исследуемой суспензии вычисляют по формуле

где М – количество клеток в 1 см³ суспензии; а – сред­нее количество клеток в квадрате сетки; h – высота каме­ры, мм; s – площадь квадрата сетки, мм²; 1000 – коэф­фициент перевода см³ в мм³; п – степень разведения ис­следуемой суспензии.

11.1.2. КАПИЛЛЯРНЫЙ МЕТОД ПРЯМОГО СЧЕТА МИКРООРГАНИЗМОВ

Для подсчета микроорганизмов Б. В. Перфильевым были разработаны специальные много­ходовые счетные капилляры с плоскими параллельными стеклами. Они имеют прямоугольное сечение и по принципу подсчета аналогичны счетной камере, их глубина и ширина опре­деляются конструкцией капилляра и представляют из­вестные величины, а длина обычно соответствует диамет­ру поля зрения микроскопа или может быть измерена. В отличие от камеры Горяева, в капиллярах Перфильева можно использовать объективы с большим увеличением, в том числе иммерсионные, что позволяет подсчитывать мелкие микроорганизмы. Поэтому такие капилляры в принципе могут применяться для подсчета микробных клеток и контроля роста бактерий в промышленной, пи­щевой, а также медицинской микробиологии. Многохо­довые капилляры представляют собой конструк­цию из нескольких (обычно 5) параллельных капиллярных яче­ек, смонтированных на спе­циальном предметном стекле. Клетки микроорганизмов подсчитывают в каждой капил­лярной ячейке, а для дальнейших расчетов используют усредненное число.

При погружении капилляра в субстрат он заполняет­ся им в силу своих капиллярных свойств. Затем заливают конец капилляра расплавленным парафином, что позво­ляет пре­дохранить содержимое капилляра от высыхания, помещают его на предметное стекло и под­считывают клет­ки, используя объективы 40×, 90× или фазово-контрастное устройство.

Для получения достоверного результата подсчитыва­ют клетки в 50–100 полях зрения, подсчет ведут во всех капиллярах. Количество клеток в 1 см³ исследуемого суб­страта опре­деляют по формуле

где М – количество клеток в 1 см³ суспензии; а – сред­нее количество клеток в капилляре длиной в диаметр поля зрения; h – глубина капилляра, мм; l – ширина капил­ляра, мм; d – диаметр поля зрения (длина капилляра) при данном увеличении микроскопа, мм; 1000 – коэффици­ент перевода см³ в мм³; п – степень разведения исследуе­мой суспензии.

11.1.3. КОМПЛЕКСНЫЙ ПОДСЧЕТ КЛЕТОК В СЧЕТНЫХ КАМЕРАХ^***

При соблюдении всех правил работы со счетными ка­мерами можно объединить в одном стекле несколько тес­тов. Это позволит существенно сэкономить время.

В пробирку внести 0,5–1,0 см³ дрожжевой взвеси и та­кое же количество раствора метиленового синего 1:40. Окрашенную суспензию выдержать 3–4 мин, тщательно перемешать и заправить ею счетную камеру.

При работе с камерой необходимо соблюдать правила ее заполнения и счета, описанные в пп. 11.1.1.

Число клеток подсчитывают с объективом 40×.

В приготовленной таким образом дрожжевой взвеси можно одновременно считать общее количество клеток, количество почкующихся клеток и мертвых почек, коли­чество мертвых клеток в 1 см³ питательного субстрата.

Поскольку жидкость под покровным стеклом быстро высыхает, необходимо быстрое проведение и фиксирова­ние результатов подсчета. Замедлить высыхание можно добавле­нием в окрашенную взвесь такого же количества 0,05%-ного водного раствора агара, что необходимо учесть в показателе п – степень разведения. В таком препарате возможно произвести и измерение размеров клеток. С этой целью лучше использовать капилляры Перфильева, при­меняя соответствующие правила подсчета.

Количество клеток в 1 см³ исследуемой суспензии вы­числяют по формуле

где М – количество клеток в 1 см³ суспензии; а – сред­нее количество клеток в квадрате сетки;
h – высота каме­ры, мм; S – площадь квадрата сетки, мм²; 1000 – коэф­фициент перевода см³ в мм³;
п – степень разведения ис­следуемой суспензии; 2 – разведение раствором синьки.

Таблица 10

Характеристика клеток дрожжевой взвеси

Результаты счета можно фиксировать в предлагаемой в качестве примера таблице 10.

11.1.4. ПОДСЧЕТ КЛЕТОК В ФИКСИРОВАННЫХ ОКРАШЕННЫХ ПРЕПАРАТАХ (МЕТОД  ВИНОГРАДСКОГО–БРИДА)

Метод применяется в различных модификациях для определения численности микро­организмов в разнообраз­ных естественных субстратах – почве, загрязненной воде, опти­чески непрозрачных средах, содержащих нераство­римые в воде компоненты, например крахмал, муку и т. д. Преимущество метода заключается еще и в том, что фик­сированные окрашенные препараты могут долго хранить­ся, поэтому подсчет можно производить в удобное для ис­следователя время.

Хорошо обезжиренное предметное стекло помещают на миллиметровую бумагу, на которой размечен прямо­угольник площадью 4 или 6 см². Затем на стекло нано­сят точно отмеренный объем исследуемой суспензии (10, 20 или 30 мкл). В некоторых случаях добавляют каплю 0,03–0,1%-ного водного раствора агара. Нанесенную сус­пензию равно­мерно распределяют петлей по площади, отмеченной на миллиметровой бумаге. Препарат подсу­шивают на воздухе, фиксируют 10–20 мин абсолютным спиртом (96°) и окрашивают эритрозином, метиленовым синим, фуксином или другим красителем. Затем препа­рат промы­вают, последовательно погружая стекло в 4­–5 сосудов с водой (промывать под про­точной водой не сле­дует) и высушивают на воздухе. В таком виде препара­ты хорошо сохраняются.

Препарат микроскопируют с иммерсионным объекти­вом. При этом подсчитывают количество клеток в квадра­тах окулярной сетки, которую помещают в окуляр между собирательной и глазной линзами. При отсутствии сетки подсчитывают число клеток в поле зрения микроскопа. Правило подсчета в квадратах окулярной сетки то же, что и в квадратах сетки счетной камеры. Чтобы результат был достоверным, клетки микро­организмов рекомендуется под­считывать в 50–100 полях зрения. Общее количество под­считанных клеток не должно быть менее 600. Количество клеток микроорганизмов в 1 см³ исследуемого субстрата вычисляют по формуле

где М – количество клеток в 1 см³ суспензии; а – сред­нее количество клеток в квадрате окулярной сетки (поле зрения); S – площадь мазка, мм²; s – площадь квадрата окулярной сетки (поля зрения), мм²; V – объем нанесен­ной на стекло суспензии, см³; п – степень разведения ис­следуемой суспензии.

Площадь квадрата сетки, или поля зрения, определя­ют с помощью объект-микрометра, который помещают на столик микроскопа вместо препарата, и при том же увеличении, при котором проводили подсчет, определяют сторону квадрата окулярной сетки или диаметр поля зре­ния. Площадь поля зрения вычисляют по формуле

S = πr².

11.1.5. ПОДСЧЕТ КЛЕТОК НА МЕМБРАННЫХ ФИЛЬТРАХ

Данный метод рекомендуется использовать для опреде­ления численности микро­организмов в субстратах с низкой плотностью клеток. Его применяют при определении коли­чества микроорганизмов в различных водоемах, при санитарно-бактериологических и некоторых других исследова­ниях. Фильтрование пробы известного объема (от несколь­ких миллилитров до литров) позволяет сконцентрировать на поверхности фильтра содержа­щиеся в пробе клетки мик­роорганизмов. Затем их окрашивают и подсчитывают.

Для фильтрования выбирают фильтр, размер пор ко­торого позволяет задерживать микро­организмы, нахо­дящиеся в субстрате. Перед использованием фильтры кипятят в дистиллированной воде для удаления возду­ха и остатков растворителей; воду следует 2–3 раза сме­нить (кипячение не должно быть слишком бурным, ина­че фильтры будут скру­чиваться). Затем фильтр помеща­ют на специальный держатель матовой стороной вверх и пропускают через него точно измеренный объем пробы.

Чем больше плотность клеток в исследуемом материа­ле, тем меньше должен быть исследуемый объем, и наобо­рот. Клетки микроорганизмов, осевшие на фильтре, ок­рашивают карболовым эритрозином. Для этого фильтр помещают нижней стороной в чашку Петри на фильтро­вальную бумагу, увлажненную красителем, чашку закры­вают крышкой и оставляют на 3–5 ч или на сутки. Для равномерного окрашивания клеток мембранный фильтр должен плотно прилегать к бумажному фильтру с эритро­зином. Затем мембранный фильтр отмывают от красите­ля, перекладывая его в чашки Петри с фильтровальной бумагой, обильно смоченной дистиллированной водой, до тех пор, пока он не перестанет ее окрашивать. После от­мывания фильтр высушивают на воздухе и готовят препарат для микроскопии. На предметное стекло наносят кап­лю иммерсионного масла и помещают на него окрашен­ный мембранный фильтр так, чтобы клетки микро­орга­низмов были сверху. На поверхность мембранного фильт­ра наносят еще каплю иммерсионного масла и покрывают фильтр покровным стеклом.

Количество клеток микроорганизмов подсчитывают с иммерсионным объективом 90× в квадратах окулярной сетки или в поле зрения микроскопа. Правила подсчета аналогичны тем, которые изложены для метода Виноградского–Брида. Количество клеток в 1 см³ исследуемого суб­страта вычисляют по формуле

где М – количество клеток в 1 см³ исследуемого субстра­та; а – среднее количество клеток в квадрате окулярной сетки (поле зрения); F – площадь мембранного фильтра, мм²; S – площадь квадрата окулярной сетки (поля зре­ния), мм²; V – объем профильтрованной жидкости, см³; 10⁶ – коэффициент перевода мм² в мкм².

При выявлении и количественном учете микроорганиз­мов широко применяют люминесцентную микроскопию. Препараты микроорганизмов готовят непосредственно из исследуемой суспензии или ее разведения либо концентри­руют клетки на специально обработанных нефлуоресцирующих фильтрах. Препараты и фильтры с микроорганиз­мами обрабатывают акридиновым оранжевым или други­ми флуоресцирующими красителями. Принципы подсчета при светлопольной и люминесцентной микроскопии оди­наковы, однако окрашенные флуорохромами клетки более четко видны на темном фоне препарата, их легче отличить от небиологических объектов и произвести подсчет более точно.

Люминесцентная микроскопия дает также возможность выявить и оценить в исследуемой пробе численность отдель­ных групп микроорганизмов. Для этого применяют специ­альные флуорохромы (например, калькофлуор белый – для выявления грибов), метод иммунофлуоресценции и др.

11.2. МЕТОДЫ ВЫСЕВА НА ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ

11.2.1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА КЛЕТОК  ВЫСЕВОМ НА ПЛОТНЫЕ ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ (МЕТОД КОХА)

Метод широко применяют для определения чис­ленности жизнеспособных клеток в различных естествен­ных субстратах и в лабораторных культурах. В его основе лежит принцип Коха, согласно которому каждая колония является потомством одной клетки. Это позволяет на осно­вании числа колоний, выросших после посева на плотную питательную среду определенного объема исследуемой сус­пензии, судить об исходном содержании в ней клеток мик­роорганизмов. Результаты количественного определения микроорганизмов, проведенного по методу Коха, часто выражают не в числе клеток, а в условных, так называе­мых колониеобразующих единицах – КОЕ.

Определение числа микроорганизмов этим методом включает три этапа: приго­товление разведений, посев на плотную среду в чашки Петри и подсчет выросших колоний.

Приготовление разведений. Численность популяции микроорганизмов обычно велика, поэтому для получения изолированных колоний необходимо приготовить ряд по­следовательных разведений. Разведения готовят в сте­рильной водопроводной воде или в 0,85%-ном растворе NaCl (физиологическом растворе). В ходе опыта целесо­образно использовать один и тот же коэффициент разве­дения, например 10, что уменьшает вероятность ошибки.

Для приготовления разведений стерильную водопро­водную воду разливают по 9 см³ в стерильные сухие про­бирки. Затем 1 см³ исследуемой суспензии стерильной пипеткой переносят в пробирку с 9 см³ стерильной воды – это первое разведение (10^-1). Полученное разведение тща­тельно перемешивают новой стерильной пипеткой, не­сколько раз вбирая в пипетку и выпуская из нее получен­ную суспензию клеток. Затем той же пипеткой отбирают 1 см³ суспензии и переносят во вторую пробирку, получая второе разведение (10^-2). Таким же образом готовят последующие разведения. Степень разведения зависит от плот­ности исследуемой популяции микроорганизмов (рис. 24).

Для приготовления каждого разведения следует обя­зательно использовать новую пипетку. Пренебрежение этим правилом приводит к получению ошибочного резуль­тата вследствие высокой способности клеток микроорга­низмов к сорбции на поверхности стекла.

Посев. Высевать суспензию можно поверхностным или глубинным способом. Перед посевом поверхностным спо­собом разливают агаризованную питательную среду в ряд стерильных чашек Петри по 15–20 см³ в каждую. Чашки оставляют на горизонтальной поверхности, пока среда не застынет. Поверхность агаризованных сред перед посевом рекомендуется подсушить для удаления конденсационной влаги в стерильном боксе или поместив их в термостат на 2–3 суток крышками вниз.

В чашку Петри с подсушенной средой вносят точно измеренный объем (0,05 или 0,1 см³) соответствующего разведения и распределяют его стеклянным шпателем по поверхности среды. Высевы на плотную среду проводят, как правило, из трех последних разведений, причем из каждого делают 2–4 параллельных высева. Посевы мож­но делать одной пипеткой, но при этом начинать следует обязательно с большего разведения. Для каждого разве­дения используют новый стерильный шпатель. После по­сева чашки Петри помещают в термостат крышками вниз.

При глубинном посеве точно измеренный объем (как правило, 0,1; 0,5 или 1,0 см³) исходной суспензии или раз­ведения вносят в расплавленную и остуженную до 45–50°С среду, тщательно перемешивают, затем немедленно вы­ливают в чашку Петри и дают среде застыть. В случае глубинного посева пользуются средой, предварительно разлитой и проавтоклавированной в пробирках.

При больших масштабах работы среду по пробиркам не разливают, а поступают следующим образом. По 1 см³ из соответствующего разведения переносят стерильной пи­петкой в 2–4 стерильные чашки Петри. Затем заливают в чашки по 15–20 см³ среды, расплавленной и остуженной до 45–50°С, и смешивают питательную среду с посевным материалом легким вращательным движением чашки по поверхности стола, после чего чашки оставляют на гори­зонтальной поверхности до застывания среды. Когда сре­да застынет, чашки Петри в перевернутом виде помеща­ют в термостат.

Работа с дрожжами не позволяет использовать метод глубинного посева ввиду интенсивного газообразования и разрыва питательной среды. Однако, используя соответ­ствующие ингибиторы дрожжевого роста, для определе­ния степени инфицирования сопутствующей бактериаль­ной микрофлорой данный метод вполне эффективен.^***

Для определения количества клеток анаэробных мик­роорганизмов чашки Петри после посева помещают в анаэростат. Иногда для определения численности анаэробов плотную среду после засева оставляют в пробирках. По­верхность застывшей среды заливают парафином. Для лучшего учета колоний микроорганизмов среды в этом случае реко­мендуется осветлять.

Подсчет выросших колоний. Колонии микроорганиз­мов в зависимости от скорости роста подсчитывают через 1–15 суток инкубации. Подсчет, как правило, проводят, не открывая чашек Петри. Для удобства каждую просчи­танную колонию отмечают точкой на наружной стороне дна чашки. При большом количестве колоний дно чашки Петри делят на сектора, просчитывают колонии в каж­дом секторе и суммируют результаты. Иногда для подсче­та колоний используют специальные полуавтоматические счетчики.

Лучшим разведением следует считать то, из которого при высеве в чашке Петри вырастает от 30–50 до 100–150 колоний. Если число выросших колоний меньше 10, то эти результаты для расчета количества клеток в исход­ном материале не используют.

Результаты параллельных высевов из одного и того же разведения суммируют и опре­де­ляют среднее число коло­ний на одной чашке.

Количество клеток в 1 см³ исследуемого субстрата вы­числяют по формуле

где М – количество клеток в 1 см³ исследуемого субстра­та; a – среднее число колоний, выросших после посева из данного разведения; V – объем суспензии, взятый для посева, см³; 10ⁿ – степень разведения.

11.2.2. УПРОЩЕННЫЙ КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ УЧЕТ ДРОЖЖЕЙ

Дрожжевые колонии в посевах учитывают следующим образом. Обратную сторону каждой чашки разделяют чер­нилами или тушью на большее или меньшее число час­тей – от четырех до шестнадцати в зависимости от густо­ты посева – и просматривают все колонии на каждой ог­раниченной площади с объективом 10× в просвечивающем микро­скопе или с бинокулярной лупой в отраженном све­те. Описывают все встре­чающиеся типы колоний в стан­дартных терминах. Из них готовят препараты и микроскопируют при больших увеличениях. Этот детальный просмотр колоний при первом посеве очень важен, так как при последующих пересевах некоторые признаки, например спорообразование, иногда исчезают. Рекомендуется сразу же делать фотографии или зарисовки. Колонии раз­ных типов нумеруют и просчитывают отдельно.

Учет производят дважды. В первый срок отмечают с обратной стороны чашки все выросшие и просчитанные колонии, а затем оставляют чашки еще на несколько дней для наблюдения за возможным появлением колоний мед­леннорастущих дрожжей.

При необходимости количественного учета расчет чис­ленности дрожжей п в единице массы или объема иссле­дуемого материала ведут по формуле

п = абв,

где а – среднее число колоний на одной чашке Петри; б – число капель в 1 см³ суспензии данного разведения; в – степень разбавления образца.

Отдельные изоляты (штаммы) получают путем пере­сева изолированных колоний в пробирки на те же среды, на которые производили первичный высев.

11.2.3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА КЛЕТОК С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ПРИБОРА ВАКУУМНОЙ ФИЛЬТРАЦИИ

Устройство прибора и порядок работы с ним. При не­обходимости количественного учета микроорганизмов при­оритетным является использование приборов вакуумной фильтрации отечественного и импортного производства. При некоторых различиях все они устроены по одному принципу (рис. 25, 26).

ис. 25

Принципиальная схема прибора вакуумной фильтрации:

1– фильтродержатель с во­рон­ками (1-, 3- или 6-секци­онный коллектор); 2 – колба Бунзена; 3 – фильтрующий блок Мидисарт; 4 – вакуум­ный насос; 5 – резиновый шланг.

Рис. 26

Принципиальная схема сборки фильтрующего узла:

1 – воронка с запорной скобой; 2 – крышка;
3 – сили­коновое кольцо; 4 – фритта из нержа­­ве­ющей стали, 
5 – силиконовая прокладка; 6 – кран.

Каждая фильтрационная система состоит из коллекто­ра с тремя или шестью приваренными фильтровальными столами, укомплектованными плоским кольцом из поли­тетрафторэтилена под фриттой из высококачественной стали, служащей в качестве опоры фильтра, и краном из высо­ко­качественной стали для регу­ли­рования вакуума в каждой отдельной фильтрационной воронке. Каждая во­ронка оснащена рычажным затвором для на­дежного кре­пежа на фильтровальный стол и крышкой с силиконовой уплотни­тельной прокладкой.

Воронка из высококачественной стали (объем 500 см³) имеет на внутренней стенке вытравленные маркировки на объе­мы 100, 200, 300, 400 и 500 см³. Воронка из высоко­качественной стали (объем 100 см³) имеет на внутренней стенке вытравленные маркировки на объемы 50 и 100 см³.

Фирма Sartorius  производит приборы вакуумной фильт­рации с полным набором сопутствующих материалов (фильтры, картонные подложки), предназначенных для решения задач микробиологического анализа в различных отраслях пищевой промышленности.

Безусловными их преимуществами являются: эконо­мия времени при обычных исследованиях – можно од­новременно фильтровать три или шесть проб; стабиль­ность результатов; практичность и удобство в обращении; независимая регулировка вакуума для каждого отдельно­го фильтрационного узла.

Микробиологические исследования с использованием прибора вакуумной фильтрации производятся в следую­щем порядке:

1. Очистить и продезинфицировать лабораторный стол.
2. Расположить в ряд стерильные питательные среды или подготовленные пита­тельные картонные подложки в чашках Петри. Положить рядом стерильно упакованные мембранные фильтры.
3. Поставить рядом с фильтрационной установкой го­релку Бунзена, стакан с неболь­шим количеством спирта и пинцет.
4. Включить источник вакуума (электрический или водоструйный насос) и снять с коллектора воронку.
5. Опалить пламенем фильтровальный стол (металли­ческую фритту). Открыть кран и провести пламя через фритту. Закрыть кран.
6. Взять воронку и опалить ее снизу.
7. Поместить металлическую воронку на фильтроваль­ный стол и опалить ее внутреннюю часть снизу вверх, про­водя пламя по спирали.
8. Опалить крышку и установить ее. Теперь этот фильт­ровальный узел стерилен. Остальные фильтровальные узлы подготавливаются таким же образом.
9. Взять стерильный мембранный фильтр плоским пинцетом, который также необхо­димо кратковременно обжечь; свободной рукой снять металлическую воронку с крышкой и положить мембранный фильтр по центру на фритту.
10. Поместить воронку на фильтровальный стол и за­крыть скобы. Таким же образом подготовить все три (или шесть) фильтрационных узлов.
11. После заполнения пробами каждой воронки от­крыть краны и фильтровать.
12. После окончания фильтрации закрыть краны. Сте­рильным пинцетом поочередно перенести фильтры с по­верхности фритт на смоченные питательные картонные подложки или питательные среды.
13. После этого чашки Петри поместить в термостат и выдержать согласно предписаниям.

Перед первым вводом в работу и после каждого упот­ребления систему нужно прочищать и высушивать. При этом она сначала промывается горячей водой, а затем опо­ласкивается дистиллированной водой. При сильном за­грязнении система дополнительно прочищается имеющи­мися в продаже лабораторными средствами для очистки (металла, стекла, пластмассы) и мягкими щетками.

При поставке краны уже смазаны консистентной смаз­кой (используется «высокова­куумная тяжелая консистент­ная смазка»). Впоследствии следует снимать, чистить, су­шить, смазывать и снова монтировать краны только в слу­чае затруднений при их открывании и закрывании. Нужно обязательно следить за тем, чтобы каждый кран был сно­ва вставлен в то же шлифованное коническое гнездо, из которого он был вынут.

После частого употребления зажимные скобы утрачи­вают зажимную способность, и может быть нарушена гер­метичность. В этом случае необходимо подтянуть зажим­ную скобу легким сжиманием плоскогубцами.

Подвижные части, подверженные трению из-за откры­вания и закрывания, должны всегда быть слегка смазаны.

Стерильные мембранные фильтры. Такие фильтры уже давно стали стандартом в повседневном микробиоло­гическом контроле качества.

Мембранные фильтры Sartorius соответствуют между­народным нормам. Фильтры поставляются готовыми к использованию и избавляют пользователя от процедуры стери­лизации. Так как они индивидуально упакованы, риск контаминации даже уже открытых фильтров край­не низок, что подтверждается сертификатом GLP. Соглас­но требованиям GLP, каждый фильтр имеет идентифика­ционный номер и номер серии на индивидуальной упаков­ке (см. табл. 11, рис. 27).

 Рис. 27

Мембранный фильтр
Sartorius Тип 114
(белый фильтр с черной сеткой)

 Все мембранные фильтры для микробиологии изготав­ливаются из нитрата целлюлозы, обеспечивающей хоро­шее удержание микроорганизмов, высокую скорость по­тока и оптимальный подсчет колоний.

Сетка, нанесенная на поверхность мембранных фильтров, с размером ячеек 3,1×3,1 мм облегчает подсчет колоний, особенно при обильном рос­те и большом количестве микроко­лоний.

Фильтры различных цветов обес­печивают контраст колоний на сво­ей поверхности, что значительно об­легчает подсчет.

Таблица 11

Характеристика стерильных мембранных фильтров Sartorius

Таблица 12

Область применения питательных картонных подложек

Питательные картонные подложки. Картонные под­ложки Sartorius в сочетании с методом мембранной фильт­рации успешно используются уже более 20 лет. Они обес­печивают простоту и легкость микробиологических иссле­дований.

Питательная картонная подложка (ПКП) – это диск из сорбирующего материала, пропитанный селективной питательной средой, а затем высушенный в специальных условиях и стерильно упакованный в чашку Петри. Ак­тивация питательной среды проводится непосредственно перед ее использованием путем смачивания подложки сте­рильной дистиллированной водой. В комплекте с подлож­ками поставляются и стерильные мембранные фильтры. Sartorius  производит 26 типов ПКП (табл. 12).

11.3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ БИОМАССЫ ВЗВЕШИВАНИЕМ

Определение биомассы состоит из трех после­довательных операций: доведение массы центрифужных пробирок или фильтров до постоянного значения; отделе­ние клеток микроорганизмов от культуральной жидкости; определение их массы. Чаще всего определяют массу су­хих клеток, хотя иногда можно ограничиться определе­нием сырой биомассы. В последнем случае первый этап отпадает; достаточно только взвесить пустую центрифуж­ную пробирку (фильтр), но не доводить ее массу до посто­янного значения. Биомассу обычно выражают в граммах или миллиграммах на литр культуральной жидкости.

Доведение массы пробирок или фильтров до постоян­ного значения. С этой целью фильтры, предварительно положенные в открытую чашку Петри или центрифуж­ные пробирки (не пластиковые), помещают в сушильный шкаф и высушивают в течение 1–2 ч при температуре 80–85°С (фильтры) или 90–100°С (пробирки). Затем чашку Петри с фильтрами или центрифужные пробирки выни­мают из сушильного шкафа и быстро переносят в эксика­тор с безводным хлористым кальцием (CaCl₂) или кон­центрированной серной кислотой. Эксикатор ставят око­ло аналитических весов, на которых будет проводиться взвешивание. Через час фильтры (пробирки) взвешивают с точностью до 0,0001 г. Высушивание и взвешивание по­вторяют, соблюдая указанную последо­ва­тель­ность опера­ций, пока масса не достигнет постоянного значения, т. е. колебания в ее определениях не будут превышать деся­тых долей миллиграмма.

Отделение микроорганизмов от среды. Осуществляет­ся центрифугированием или фильтрованием. В центри­фужную пробирку наливают точно измеренный объем тща­тельно перемешанной жидкой культуры, который в зависимости от ее плотности колеблется от 5 до 20 см³. Время центрифугирования и число оборотов зависят от размеров клеток. Чем они меньше, тем больше требуется оборотов и тем продолжительнее должно быть время цен­трифугирования. Чаще всего центрифугируют 20–30 мин при
3–5 тыс. об/мин. После центрифугирования надосадочную жидкость осторожно сливают, осадок промывают слегка подкисленной дистиллированной водой (1 см³ кон­центри­рованной НСl на 1000 см³ воды) и снова центрифу­гируют при том же числе оборотов. Супернатант сливают сразу после остановки центрифуги. В противном случае часть осадка может быть потеряна.

Мицелий актиномицетов и грибов отделяют фильтро­ванием. Бумажный фильтр поме­щают в стеклянную во­ронку и фильтруют через него точно измеренный объем культуры – от 5 до 10 см³. Осадок на фильтре многократ­но промывают подкисленной дистилли­рованной водой.

Для отделения бактерий используют мембранные фильт­ры. Размеры пор мембранного фильтра должны быть мень­ше величины клеток, биомассу которых определяют. Мем­бранный фильтр помещают на пористую пластинку специ­ального держателя, вставлен­ного в колбу. Чтобы ускорить фильтрование, установку подключают к водоструйному насосу. Осадок несколько раз промывают подкисленной водой.

Определение биомассы. Чтобы определить массу су­хих клеток, центрифужную пробирку или фильтр с осад­ком клеток микроорганизмов помещают в сушильный шкаф, высушивают и взвешивают. Режим высушивания и взвешивания тот же, что использовали и при определе­нии массы пробирок или фильтров. Сухую биомассу опре­деляют по формуле

где М – сухая биомасса г/л; А – масса фильтра (пробир­ки) с осадком, г; В – масса фильтра (пробирки) без осад­ка, г; V – объем культуральной жидкости, взятый для фильтрования (центрифугирования), см³.

Точность метода определяется полнотой отмывания клеток от компонентов среды и тщательностью взвеши­вания.

11.4. ОПТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ КОЛИЧЕСТВЕННОГО УЧЕТА

11.4.1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА КЛЕТОК И БИОМАССЫ НЕФЕЛОМЕТРИЧЕСКИМ МЕТОДОМ

Питательная среда для культивирования мик­роорганизмов, в которой предполагается определять чис­ло клеток по светорассеянию, должна быть оптически про­зрачной.

Изменение интенсивности света при прохождении че­рез суспензию клеток измеряют с помощью нефелометра, фотоэлектроколориметра (ФЭК) или спектрофотометра, выбирая длину волны (обычно в интервале 540 – 650 нм), при которой поглощение света данной суспензией клеток минимальное. При высоких концентрациях клеток в куль­туральной среде происходит вторичное рассеяние света, что приводит к занижению результатов. Правила работы на указанных приборах подробно изложены в прилагае­мых к ним инструкциях.

В некоторых случаях плотность клеточной суспензии выражают в показателях нефелометра. Однако чаще стро­ят калибровочные кривые между величиной светорассея­ния и числом клеток или сухой биомассой в единице объ­ема. Для построения калибро­вочной кривой поступают следующим образом. Измеряют величину оптической плот­ности суспензии с различным содержанием клеток и в каждой из них определяют одним из применяемых ме­тодов количество клеток или биомассу. Полученную за­висимость выражают графически, откладывая на оси ор­динат показания прибора, а на оси абсцисс – количество клеток, содержащихся в 1 см³ суспензии, или биомассу в г/л. Для каждого микроорганизма следует строить свою калибровочную кривую.

11.4.2. СТАНДАРТЫ МУТНОСТИ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ

В ряде случаев количество клеток в суспензии бывает достаточно определить визу­ально путем сравнения со стан­дартом мутности. Стандарты мутности представляют со­бой взвесь частиц стекла пирекс в дистиллированной воде. За единицу стандарта мутности условно принята мутность суспензии (в физиологическом растворе) бактерий – воз­будителей тифа с концентрацией клеток 100 млн/см³. Стандарт мутности включает четыре эталона на 11, 10, 9 и 5 единиц, что соответствует содержанию 1,1·10⁹; 1,0·10⁹; 0,9·10⁹ и 0,5·10⁹ клеток в 1 см³ взвеси. Для определения количества клеток пробирку с исследуемой суспензией ставят рядом с эталоном 10 и рассматривают их в отра­женном и проходящем свете на фоне белого листа бума­ги, в центре которого нанесено несколько черных линий. Эталоны 9 и 11 вспомогательные, позволяющие более четко сравнить мутность иссле­дуемой суспензии бакте­рий с эталоном. Стандартизация мутности суспензии бак­терий (особенно часто в случае тест-организмов) имеет су­щественное значение при приготов­лении посевного мате­риала в серийных опытах.

При работе с дрожжами данным методом выбранный эталон требует предварительной калибровки каким-либо из описанных методов. Необходимость такой процедуры вызвана значительно большим размером дрожжевых кле­ток и существенными межрасовыми различиями.