8 Проведение испытания
Схема проведения испытания приведена в приложении Б.
8.1 Навеска и исходное разведение
8.1.1 Общие положения
Для приготовления исходной суспензии используют как разбавитель неселективную среду, указанную в 5.2.1 и 4.2 (забуференную пептонную воду).
Если масса пробы иная, чем 25 г, используют необходимое количество неселективной среды, исходя из соотношения 1:10.
Для уменьшения объема работы, когда испытывают больше одной пробы от определенного продукта и когда очевидно, что объединенная навеска не влияет на результат испытания, - навески объединяют.
Пример - Если необходимо исследовать 10 навесок по 25 г, их объединяют и к 250 г добавляют 2,25 дм3 неселективной среды.
8.1.2 Специфичность приготовления исходной суспензии для некоторых продуктов
Указанная специфичность приготовления может быть применена только для выявления бактерий рода Salmonella.
8.1.2.1 Какао и какаосодержащие продукты (массовая доля какао более 20 %)
Добавляют в забуференную пептонную воду (см. 5.2.1) 50 г некислого казеина или 100 г/дм3 обезжиренного молочного порошка и, если пищевые продукты предположительно содержат большое количество грамположительных микроорганизмов, прибавляют после 2 ч инкубирования 0,018 г/дм3 бриллиантового зеленого (3,6 см3/дм3 раствора, приготовленного по В.4.4). Казеин и молочный порошок добавляют при приготовлении забуференной пептонной воды до стерилизации.
8.1.2.2 Кислые и кислотосодержащие пищевые продукты
При неселективном обогащении должна быть гарантия того, что pH не будет ниже 4,5.
pH кислых и кислотосодержащих продуктов стабилизируют путем использования забуференной пептонной воды двойной концентрации.
Допускается также при высеве жидких высококислотных продуктов для предотвращения снижения pH сред на 0,5 и более pH продукта перед посевом доводить до (7,0 ± 0,2).
При высеве твердых высококислотных продуктов доводят pH до (7,0 ± 0,2) в посевах.
Доведение pH проводят с соблюдением правил асептики с помощью стерильных растворов гидроокиси натрия и соляной кислоты, приготовленных по ГОСТ 10444.1. Количество добавляемых растворов устанавливают опытным путем.
8.2 Неселективное обогащение
Инкубируют исходную суспензию (см. 8.1.1) при температуре (37 ± 1) °С в течение (18 ± 2) ч.
8.3 Селективное обогащение
Культуры, полученные после инкубирования по 8.2, пересевают в среды для селективного обогащения. Для этого по 1 см3 культуры пересевают в 10 см3 RVS-бульона и в 10 см3 селенитовой среды или в 10 см3 тетратионатного бульона Мюллер-Кауфмана.
Посевы на RVS-бульоне инкубируют при температуре (41,5 ± 1,0) °С в течение (24 ± 3) ч (следят за тем, чтобы температура не превышала 42,5 °С), а на тетратионатном бульоне и селенитовой среде посевы инкубируют при температуре (37 ± 1) °С в течение (24 ± 3) ч.
Если из одного пищевого продукта проведен высев нескольких навесок (каждой отдельно) для выявления бактерий рода Salmonella, то допускается из каждого посева по 8.2 пересев проводить в один флакон с каждой селективной питательной средой (RVS-бульоном, тетратионатным бульоном Мюллер-Кауфмана, селенитовой средой). При этом количество селективной среды во флаконе должно быть увеличено по сравнению с 10 см3 во столько раз, из скольких посевов проводят пересев.
Свежие продукты, не содержащие поврежденных микроорганизмов, подвергнутые каким-либо воздействиям, например сушке, заморозке и другим, допускается высевать непосредственно в селективные среды, минуя этап неселективного обогащения. Соотношение между количеством высеваемого продукта и средой должно быть не менее 1:10.
8.4 Пересев на чашки и идентификация
8.4.1 Культуры через 24 ч инкубирования на селективных средах пересевают по ГОСТ 26670 так, чтобы получить хорошо изолированные колонии, на XLD-arap и на одну из агаризованных сред: висмут-сульфит агар, среду Плоскирева, среду Эндо, среду Левина или бриллиантовый зеленый агар.
При отсутствии больших чашек используют для посева петлей две средние чашки (одну за другой).
8.4.2 Чашки переворачивают (см. 8.4.1) вверх дном и помещают в термостат при температуре (37 ± 1) °С.
8.4.3 После инкубирования в течение (24 ± 3) ч, а на бриллиантовом зеленом агаре – 48 ч, про¬сматривают чашки (см. 8.4.2) и отмечают присутствие типичных колоний бактерий рода Salmonella и не совсем типичных колоний, которые могут быть бактериями рода Salmonella. Отмечают их местоположе¬ние на дне чашки.
Типичные колонии бактерий рода Salmonella, вырастающие на XLD-arape, имеют черный центр и слегка прозрачную зону красноватого цвета, что принадлежит цвету индикатора.
Бактерии рода Salmonella Н2S-отрицательные варианты (например, S. Paratyphi А) образуют на XLD-arape розовые колонии с темным розовым центром, лактозоположительные бактерии рода Salmonella на XLD-arape – желтые колонии с почернением или без него.
На висмут-сульфит агаре бактерии рода Salmonella образуют черные колонии с характерным металлическим блеском, а также зеленоватые с темно-зеленым ободком и с пигментированием сре¬ды под колониями.
На среде Эндо бактерии рода Salmonella образуют круглые бесцветные или слегка розоватые, прозрачные колонии.
На среде Плоскирева бактерии рода Salmonella образуют бесцветные прозрачные, но более плотные, чем на среде Эндо, колонии.
На среде Левина бактерии рода Salmonella образуют прозрачные, слабо-розовые или розовато-фиолетовые колонии.
На бриллиантовом зеленом агаре бактерии рода Salmonella образуют красноватые или розовые, почти белые колонии (их цвет зависит от штамма и срока инкубирования). Лактозоположительные и сахарозоположительные микроорганизмы образуют зеленоватые колонии, окруженные яркой желто-зеленой зоной.
Агар с бриллиантовым зеленым применяют для выделения сальмонелл, кроме Salmonella Typhi и Salmonella Paratyphi.
Отсутствие в посевах на селективно-диагностических средах типичных или не совсем типичных колоний для бактерий рода Salmonella свидетельствует об отсутствии бактерий рода Salmonella в анализируемой навеске (объеме) продукта.
При наличии хотя бы на одной селективно-диагностической среде типичных или не совсем типичных колоний для бактерий рода Salmonella проводят их дальнейшую идентификацию.
8.5 Идентификация
8.5.1 Общие положения
Для определения биохимических признаков бактерий рода Salmonella допускается использование наборов тест-систем. Эти наборы используют в соответствии с инструкцией изготовителя.
Для биохимической идентификации допускается использование тест-систем промышленного производства, зарегистрированных в странах, присоединившихся к стандарту, например «API 20E», «Rapid 20Е».
8.5.3. Выделение колоний для идентификации
Для идентификации берут с каждой чашки (две чашки среднего или одну большого размера) каждой селективной среды (см. 8.4.3) сначала одну колонию типичную или не совсем типичную, а затем четыре колонии, если первая окажется отрицательной.
Рекомендуется брать сразу пять колоний для идентификации в случае эпидемиологической ситуации. Если на одной чашке менее пяти типичных или не совсем типичных колоний, то для идентификации берут все колонии.
Переносят отобранные колонии на поверхность предварительно подсушенного питательного агара (см. 5.2.6) или мясо-пептонного агара, или ГРМ-агара (см. 5.2.7) в чашках Петри или на скошенную поверхность среды в пробирках. Для подтверждения берут полностью изолированные колонии. Инкубируют инокулированные чашки или пробирки при температуре (37 ± 1) °С в течение (24 ± 3) ч.
Используют только чистые культуры для биохимической и серологической идентификации.
8.5.2.1 Окраска по рамму
Из отобранных для биохимической идентификации колоний готовят мазки и окрашивают по рамму по ГОСТ 30425.
Бактерии рода Salmonella являются грамотрицательными палочками с закругленными концами.
8.5.3 Биохимическая идентификация
У отобранных и предварительно пересеянных грамотрицательных культур изучают характер роста на трехсахарном железистом агаре (TSI-arape) или агаре Клиглера, или среде Олькеницкого, возможность расщепления мочевины, образования ацетоина, индола, β-галактозидазы, L-лизиндекарбоксилазы, ферментации сахарозы и маннита, а также подвижность.
8.5.3.1 Общие положения
Петлей инокулируют специфические среды, указанные в 8.5.3.2-8.5.3.9, каждой культурой, полученной из колоний по 8.5.2.
8.5.3.2 TSI-arap (см. 5.2.10), среда Олькеницкого или агар Клиглера
Засевают штрихом скошенную поверхность агара (среды Олькеницкого) и уколом – столбик. Инкубируют при температуре (37 ± 1) °С в течение (24 ± 3) ч. Интерпретируют изменения в среде следующим образом:
а) столбик агара (среды Олькеницкого)
- желтый – глюкоза положительная (глюкозу ферментирует);
- красный или неизменившийся – глюкоза отрицательная (глюкозу не ферментирует);
- черный – образование сероводорода;
- пузырьки или разрывы – образование газа из глюкозы;
б) скошенная поверхность агара (среды Олькеницкого)
- желтая – лактоза и/или сахароза положительные (лактозу и/или сахарозу ферментирует);
- красная или неизменившаяся – лактоза и сахароза отрицательные (ни лактозу, ни сахарозу не ферментирует).
Агар Клиглера содержит два сахара, поэтому по скошенной поверхности учитывают только ферментацию лактозы.
Типичные культуры бактерий рода Salmonella показывают щелочную (красную) поверхность и кислый (желтый) столбик с образованием газа (пузырьков), и примерно в 90% случаев образуется сероводород (черный агар).
Если изолированы лактозоположительные бактерии рода Salmonella, то поверхность TSI-arapa желтая. Предварительное определение культур бактерий рода Salmonella не может основываться только на результатах теста на TSI-arape.
Дальнейшему изучению подвергают также лактозоположительные бактерии или бактерии, не образующие сероводород, но обязательно ферментирующие глюкозу с образованием или без образова¬ния газа.
8.5.3.5 Агар с мочевиной (агар Кристенсена) (см. 5.2.11)
Культуры пересевают штрихом на поверхность агара Кристенсена с мочевиной. Посевы инкубируют при температуре (37 ± 1) °С в течение (24 ± 3) ч, наблюдая за посевами через определенные промежутки времени.
При положительной реакции – расщеплении мочевины с выделением аммония цвет фенолового красного меняется от розового до светло-вишневого.
Для уреазоположительных бактерий реакция часто становится видимой после 2 ч инкубирования.
Бактерии рода Salmonella не расщепляют мочевину.
8.5.3.5 L-лизиндекарбоксилазная среда (см. 5.2.12)
Инокулируют снизу жидкую среду. Посевы инкубируют при температуре (37 ± 1)°С в течение (24 ± 3) ч.
Помутнение и пурпурный цвет среды после инкубирования указывают на положительную реакцию. Желтый цвет указывает на отрицательную реакцию.
Salmonella Paratyphi А не образует L-лизиндекарбоксилазу, остальные образуют.
8.5.3.5 Определение β-галактозидазы (5.2.13)
Суспендируют петлей культуру в 0,25 см3 физиологического раствора, прибавляют одну каплю толуола и встряхивают пробирку. Помещают пробирку в водяную баню при температуре 37 °С и оставляют примерно на 5 мин. Затем добавляют 0,25 см3 реактива для определения β-галактозидазы и перемешивают.
Оставляют пробирку в водяной бане при температуре 37 °С в течение (24 ± 3) ч, наблюдая за изменением цвета через определенные промежутки времени.
Желтый цвет указывает на положительную реакцию. Изменение цвета обнаруживается примерно через 20 мин.
Бактерии рода Salmonella, кроме S. Arizonae, не обладают β-галактозидазой.
Для определения β-галактозидазной активности допускается использование ONPG-дисков. Для этого испытуемые культуры высевают на среду, содержащую лактозу в концентрации 0,1 %, или агар Клиглера, или трехсахарный агар, или агар Олькеницкого. Посевы инкубируют в течение (18 ± 2) ч при температуре (37 ± 1) °С. Петлей отбирают выросшую культуру и готовят из нее густую суспензию в 0,5 см3 стерильной дистиллированной воды. К полученной суспензии добавляют один ONPG-диск и помещают в водяную баню при температуре (37 ± 1) °С. Желтое окрашивание, появившееся через 15-20 мин, указывает на положительную реакцию. Для окончательного учета отрицательного результата посевы продолжают инкубировать в течение 2,4 и 24 ч.
8.5.3.6 Определение образования ацетоина (реакция Фогес-Проскауера) (5.2.14)
Суспендируют петлей испытуемую культуру в стерильной пробирке, содержащей 3 см3 VP среды или мясо-пептонного бульона с глюкозой.
Посевы инкубируют при температуре (37 ± 1) °С в течение (24 ± 3) ч.
После инкубации прибавляют две капли раствора креатина, три капли спиртового раствора 1-нафтола и две капли раствора гидроокиси калия, перемешивают содержимое пробирки после прибавления каждого реактива.
Появление через 15 мин от розового до светло-красного окрашивания указывает на положительную реакцию.
Бактерии рода Salmonella не образуют ацетоина (реакция Фогес-Проскауера отрицательная).
Допускается определение ацетоина проводить без применения раствора креатина. Для этого после инкубирования к 1 см3 отобранной культуральной жидкости прибавляют 0,6 см3 раствора 1-нафтола и 0,2 см3 раствора гидроокиси калия. После прибавления каждого реактива пробирку встряхивают. Появление розового окрашивания через 15 мин указывает на положительную реакцию.
8.5.3.7 Определение образования индола (см. 5.2.15)
Культуры пересевают в пробирку, содержащую 5 см3 триптон/триптофановой среды, или в бульон Хоттингера, или в мясо-пептонный бульон с L-триптофаном. Посевы инкубируют при температуре (37 ± 1) °С в течение (24 ± 3) ч.
После инкубирования к посевам прибавляют по каплям 1 см3 реактива Эрлиха или Ковача, содержимое пробирки перемешивают.
Образование красного кольца указывает на положительную реакцию. Желто-коричневое кольцо указывает на отрицательную реакцию.
Бактерии рода Salmonella не образуют индол.
8.5.3.8 Определение ферментации маннита и сахарозы
Культуры пересевают в среды Гисса с маннитом или сахарозой. Посевы инкубируют при температуре (37 ± 1) °С в течение (24 ±3) ч.
Бактерии рода Salmonella не ферментируют сахарозу, но ферментируют маннит. При сбраживании маннита цвет среды изменяется, образуется или не образуется газ.
8.5.3.9 Определение подвижности
Культуры пересевают уколом в полужидкий питательный агар или полужидкий мясо-пептонный агар.
Посевы инкубируют при температуре (37 ± 1) °С в течение (24 ± 3) ч.
При росте подвижных культур отмечается диффузионный рост по всему столбику агара, при росте неподвижных культур - вокруг места укола.
Бактерии рода Salmonella подвижны, кроме S. gallinarum и S. pullorum.
8.5.3.10 Интерпретация биохимических тестов приведена в таблице А.1 (приложение А).
8.5.4 Серологическая идентификация
8.5.4.1 Общие положения
Определение присутствия соматического О-антигена, антигена вирулентности Vi-, жгутикового Н-антигена в изолированных колониях (см. 8.5.2) проводят с помощью реакции агглютинации на пред¬метном стекле с соответствующими сыворотками после исключения самоагглютинирующих штаммов. Сыворотки используют в соответствии с инструкцией изготовителя, если есть отличие от описания, при¬веденного ниже.
Серологическую идентификацию для подтверждения принадлежности к бактериям рода Salmonella проводят с культурами, предварительно пересеянными на поверхность мясо-пептонного агара или ГРМ-агара.
8.5.4.2 Исключение самоагглютинирующих штаммов
Помещают каплю физиологического раствора на тщательно очищенное предметное стекло. Диспергируют в этой капле часть тестируемой колонии так, чтобы получилась гомогенная и густая суспензия.
Допускается размешивание части колонии в капле воды и перемешивание этого раствора с одной каплей физиологического раствора.
Покачивают осторожно стекло в течение 30-60 с. Отмечают результаты на темном фоне, лучше с помощью увеличительного стекла. Если наблюдается в разной степени склеивание бактерий, то есть образование осадка, то считают, что тестируемые штаммы обладают самоагглютинацией.
Штаммы бактерий, обладающие самоагглютинацией, не подвергают дальнейшей серологической идентификации.
9 Определение наличия О-антигенов
Штаммы, у которых не выявлено самоагглютинации, испытывают в реакции агглютинации с агглютинирующими адсорбированными поливалентными сальмонеллезными О-сыворотками основных групп А, В, С, О, Е, а затем, если не выявлено О-антигенов с сыворотками основных групп, ставят реакцию с сыворотками редких групп.
Подготовка сывороток к постановке реакции агглютинации и методика ее проведения указаны в инструкции, прилагаемой к сывороткам.
Агглютинация (наличие О-антигенов) проявляется в виде склеивания бактериальной массы и полного или частичного просветления жидкости.
При отрицательной реакции агглютинации культура после тщательного смешивания с каплей сыворотки образует гомогенную смесь.
Используют поли- и моновалентные сыворотки, одну после другой.
10 Определение Vi- и Н-антигенов
Наличие Vi- и Н-антигенов определяют при необходимости по санитарно-эпидемиологическим показаниям.
Перед выявлением Н-антигенов испытуемой культурой инокулируют полужидкий агар. Посевы инкубируют при температуре (37 ± 1) °С в течение (24 ± 2) ч. Полученную культуру используют для выявле¬ния Н-антигенов.
Наличие Vi- и Н-антигенов определяют, пользуясь указаниями, приведенными в 8.5.4.3. 8.5.5 Интерпретация биохимических и серологических реакций
Интерпретация подтверждающих тестов (см. 8.5.3 и 8.5.4) для испытанных колоний (см. 8.5.2) приведена в таблице 1.
Таблица 1 – Интерпретация подтверждающих тестов
Биохимические реакции Самоагглютинация Серологические реакции Интерпретация
Типичные Нет О-, Vi- или Н-антигены положительные Штамм относится к бактериям рода Salmonella
Типичные Нет Все реакции отрицательные Могут быть бактерии рода Salmonella
Типичные Да Не тестируется (см. 8.5.4.2) Могут быть бактерии рода Salmonella
Нетипичные реакции Нет/Да О-, Vi- или Н-антигены положительные Могут быть бактерии рода Salmonella
Нетипичные реакции Нет/Да Все реакции отрицательные Не относятся к бактериям рода Salmonella
При определении биохимических и серологических характеристик выделенных культур в качес-тве контроля используют типичный по этим показателям штамм бактерий рода Salmonella, указанный в разделе 6.
Культуры, предположительно отнесенные к бактериям рода Salmonella, передают в компетентные аккредитованные центры по изучению этих бактерий для окончательной идентификации. Культуру при этом сопровождают всей полученной информацией с указанием наименования продукта, из которого выделен штамм.
В этом случае результаты выявления бактерий рода Salmonella выдают после получения ответа по окончательной идентификации.
При выявлении бактерий рода Salmonella используют схему, указанную в приложении Б.
