Приборы и посуда: чашки Петри, водяная баня, стерильная пипетка, пробирки, термостат, лупа.
Материалы и реактивы: питательная среда на агаре.
Порядок выполнения работы
1. Отбор пробы.
Для отбора проб воды используют стерильные флаконы вместимостью 0,5 л с пробкой. Проба должна быть исследована не позднее чем через 2 ч после отбора.
2. Определение общего числа бактерий в воде. Сущность метода заключается в определении в 1 мл воды общего содержания мезофильных, мезотрофных аэробов и факультативных анаэробов, способных расти на питательной агаризованной среде данного состава при температуре 37±0,5°С в течение 24±2 ч, при этом образовывать колонии, видимые при увеличении в 2-5 раз. Питательную среду расплавляют в водяной бане и охлаждают до температуры 45±5°С.
Стерильные чашки Петри раскладывают на столе и пишут на крышках номер пробы, дату посева и объем посеянной воды.
Из каждой пробы должен быть сделан посев не менее двух различных объемов, выбранных с таким расчетом, чтобы на чашках Петри выросло от 30 до 3000 колоний. При исследовании водопроводной воды засевают в каждую из двух чашек по 1 мл.
С флаконов с пробами снимают бумажные колпачки, вынимают пробки, горлышки фламбируют (держат несколько секунд над пламенем), после чего воду тщательно перемешивают осторожным продуванием воздуха через стерильную пипетку. Стерильной пипеткой отбирают соответствующие объемы воды и вносят в стерильные чашки, слегка приоткрывая крышку.
Для посева 0,1 мл и меньших объемов воды используют разведения анализируемой воды. Для этого в пробирку с 9 мл стерильной воды вносят 1 мл анализируемой воды. При этом пипетка должна быть опущена ниже поверхности воды не более чем на 3 мм, чтобы избежать смывания бактерий с наружной стороны. Другой стерильной пипеткой продуванием воздуха тщательно перемешивают содержимое пробирки, отбирают из нее 1 мл и переносят в чашку, что будет соответствовать посеву 0,1 мл анализируемой воды. При необходимости посева меньших объемов воды этой же пипеткой переносят 1 мл содержимого первой пробирки в следующую, с 9 мл стерильной воды. Посев 1 мл из второй пробирки будет соответствовать посеву 0,01 мл анализируемой воды и т. д.
После внесения воды в чашку Петри ее заливают 10-12 мл остывшей питательной среды при фламбировании краев посуды со средой. Воду быстро смешивают с питательной средой, осторожно наклоняя или вращая чашку по поверхности стола. Необходимо избегать образования пузырьков воздуха, незалитых частей дна чашки, попадания среды на края и крышку. После этого чашки оставляют на горизонтальной поверхности до застывания среды. Затем чашки с посевами помещают в термостат вверх дном не более чем по 4 чашки вместе. Посевы выращивают при 37±0,5°С в течение 24 ч.
Колонии, выросшие как на поверхности, так и в глубине агара, подсчитывают при помощи лупы с увеличением в 2-5 раз или прибора 1 для счета колоний. Для этого чашку кладут вверх дном на черный фон. Для большей точности каждую подсчитанную колонию отмечают со стороны дна специальной тушью или чернилами. Оценивают только те разведения, при посеве которых на чашке выросло от 30 до 300 колоний. При посеве 1 мл неразведенной пробы учитывают любые количества колоний, но не превышающие 300.
Если в чашке1 с наиболее высоким разведением выросло свыше 300 колоний и анализ нельзя повторить, допускается подсчитывать колонии при помощи пластинки с сеткой и лупы при сильном боковом освещении. Подсчитывают не менее 20 квадратов площадь в 1 см2 каждый в разных местах чашки, затем выводят среднее арифметическое числа колоний, приходящихся на 1 см2. Эту величину умножают на площадь чашки S (в см2), вычисленную по формуле S = πR2.
Результаты подсчета колоний в каждой чашке выражают числом бактерий в 1 мл анализируемой воды с учетом посеянного объема. За окончательный результат принимают среднее арифметическое результата подсчета на двух параллельных чашках или разных разведений. Результат округляют следующим образом: если результат находится в пределах чисел от 1 до 100, записывают те числа, которые получены; если результат находится в пределах от 101 до 1000, округляют до 10; если результат находится в пределах чисел от 1001 до 10000, округляют до 100 и т. д.
Число колоний учитывают, ориентируясь на одну чашку в следующих случаях: если на другой чашке при посеве из разведения выросло не менее 20 колоний; при ползучем росте бактерий, распространившемся на всю поверхность чашки или занимающем значительные зоны и маскирующимся ростом других колоний; при количестве колоний свыше 300. Счетную пластинку рекомендуется применять при подсчете числа колоний, когда на обеих чашках отмечен ползучий рост. При этом подсчитывают квадраты на свободных от сплошного роста местах чашки.
3. Написать отчет о проделанной работе.
