Метод титра, или предельных разбавлений, применяется для установления количества микроорганизмов определенных физиологических групп (например, бактерий молочно-кислых, уксусно-кислых, бактерий группы кишечной палочки и др.) на товарах и материалах.
Сущность метода состоит в том, что исследуемый материал в определенных количествах (берется последовательный ряд десятикратных разведений, подготовленных для анализа пробы) высевается в сосуды с элективной, т. е. избирательной для определяемых микроорганизмов, питательной средой. Выращиваются посевы также в наиболее благоприятных условиях для развития искомых микроорганизмов (температура, доступ воздуха и др.) и в то же время благоприятных для развития других. По прошествии необходимого срока выращивания посевов устанавливают, в каком наименьшем количестве исследуемого материала (в каком предельном разведении его) находились представители данной группы, т. е. определяют их титр. Выявляются искомые микроорганизмы по типичным для них изменениям питательной среды.
В практике оценки доброкачественности, пищевых продуктов, питьевой воды, при характеристике санитарного состояния производства и в других случаях метод предельных разбавлений применяется для учета бактерий группы кишечной палочки (группы коли-бактерий). В эту группу входят кишечная палочка и некоторые родственные ей виды.
Обнаружение кишечной палочки на пищевых продуктах, оборудовании, на руках обслуживающего персонала свидетельствует о фекальном загрязнении их. Фекальное загрязнение в свою очередь указывает на возможное присутствие бактерий коли-тифозной группы (дизентерийных, брюшно-тифозных, паратифозных), которые, так же как и кишечная палочка, выделяются во внешнюю среду с фекалиями больных и бациллоносителей. Непосредственное выявление этих патогенных бактерий представляет большие трудности, поэтому об их возможном присутствии судят косвенным путем, определяя загрязненность исследуемого объекта кишечной палочкой.
Бактерии коли-группы являются, таким образом, санитарно-показательными микроорганизмами. Для санитарно-гигиенической оценки воды, пищевых продуктов и других объектов важно установить не только наличие этих бактерий, но и их количество, что позволяет судить о степени фекального загрязнения. Чем больше обнаружено санитарно-показательных микроорганизмов, тем с большей вероятностью можно ожидать наличия на исследуемом объекте возбудителей инфекционно-кишечных заболеваний и тем более низкая оценка должна быть дана санитарному состоянию исследуемого объекта. Количество кишечных палочек, определяемое методом титра, выражают коли-титром и коли-индексом.
Коли-титр — это наименьшее количество исследуемого объекта (в г или мл), в котором обнаруживают кишечную палочку.
Коли-индекс — копичество кишечных палочек в единице объема или массы исследуемого объекта.
Для определения методом титра обсемененности исследуемого объекта бактериями группы кишечной палочки проба исследуемого объекта отбирается и подготавливается к анализу, как указано в задании на метод счета колоний, но при исследовании твердого продукта из средней пробы для анализа берется не 1-5 г, а 10 г.
Метод титра, или предельных разбавлений, применяется для установления количества микроорганизмов определенных физиологических групп (например, бактерий молочно-кислых, уксусно-кислых, бактерий группы кишечной палочки и др.) на товарах и материалах.
Сущность метода состоит в том, что исследуемый материал в определенных количествах (берется последовательный ряд десятикратных разведений, подготовленных для анализа пробы) высевается в сосуды с элективной, т. е. избирательной для определяемых микроорганизмов, питательной средой. Выращиваются посевы также в наиболее благоприятных условиях для развития искомых микроорганизмов (температура, доступ воздуха и др.) и в то же время благоприятных для развития других. По прошествии необходимого срока выращивания посевов устанавливают, в каком наименьшем количестве исследуемого материала (в каком предельном разведении его) находились представители данной группы, т. е. определяют их титр. Выявляются искомые микроорганизмы по типичным для них изменениям питательной среды.
В практике оценки доброкачественности, пищевых продуктов, питьевой воды, при характеристике санитарного состояния производства и в других случаях метод предельных разбавлений применяется для учета бактерий группы кишечной палочки (группы коли-бактерий). В эту группу входят кишечная палочка и некоторые родственные ей виды.
Обнаружение кишечной палочки на пищевых продуктах, оборудовании, на руках обслуживающего персонала свидетельствует о фекальном загрязнении их. Фекальное загрязнение в свою очередь указывает на возможное присутствие бактерий коли-тифозной группы (дизентерийных, брюшно-тифозных, паратифозных), которые, так же как и кишечная палочка, выделяются во внешнюю среду с фекалиями больных и бациллоносителей. Непосредственное выявление этих патогенных бактерий представляет большие трудности, поэтому об их возможном присутствии судят косвенным путем, определяя загрязненность исследуемого объекта кишечной палочкой.
Бактерии коли-группы являются, таким образом, санитарно-показательными микроорганизмами. Для санитарно-гигиенической оценки воды, пищевых продуктов и других объектов важно установить не только наличие этих бактерий, но и их количество, что позволяет судить о степени фекального загрязнения. Чем больше обнаружено санитарно-показательных микроорганизмов, тем с большей вероятностью можно ожидать наличия на исследуемом объекте возбудителей инфекционно-кишечных заболеваний и тем более низкая оценка должна быть дана санитарному состоянию исследуемого объекта. Количество кишечных палочек, определяемое методом титра, выражают коли-титром и коли-индексом.
Коли-титр — это наименьшее количество исследуемого объекта (в г или мл), в котором обнаруживают кишечную палочку.
Коли-индекс — количество кишечных палочек в единице объема или массы исследуемого объекта.
Для определения методом титра обсемененности исследуемого объекта бактериями группы кишечной палочки проба исследуемого объекта отбирается и подготавливается к анализу, как указано в задании на метод счета колоний, но при исследовании твердого продукта из средней пробы для анализа берется не 1-5 г, а 10 г.
При исследовании мясных и молочных продуктов посев их производится на питательную среду Кесслера (пептонная вода с бычьей желчью, лактозой и генцианвиолетом).
Среда Несслера. Готовят ее следующим образом: к 1 л водопроводной воды прибавляют 10 г пептона и 50 мл желчи (бычьей или других сельскохозяйственных животных). При помешивании прогревают смесь в течение 20-30 мин на водяной кипящей бане, после чего фильтруют через вату. В фильтрате растворяют 2,5 г глюкозы, доводят объем до 1 л, устанавливают с помощью раствора соляной кислоты или едкого натра рН 7,4-7,6 и после этого добавляют 2 мл водного 1%-ного раствора кристаллвиолета (кристаллического фиолетового).
Полученную среду разливают в пробирки с поплавками и стерилизуют при 1 эти в течение 10 мин.
Готовая среда должна иметь темно-фиолетовую окраску.
При анализе жидкого продукта или смывов с рук, оборудования и с других объектов стерильной пипеткой вносят 1 мл исследуемой жидкости в первую пробирку с питательной средой и той же пипеткой — 1 мл жидкости в пробирку с 9 мл стерильной воды (первое разведение).
Новой пипеткой из пробирки первого разведения переносят 1 мл во вторую пробирку с питательной средой и 1 мл во вторую пробирку с 9 мл стерильной воды (второе разведение).
Из второго разведения 1 мл жидкости переносят в третью пробирку с питательной средой и той же пипеткой — 1 мл в третью пробирку с 9 мл стерильной воды (третье разведение).
Из третьего разведения новой пипеткой 1 мл жидкости вносят в четвертую пробирку с питательной средой. В результате в пробирки с элективной питательной средой будет внесено -исследуемой жидкости (в мл): 1; 0,1; 0,01; 0,001.
Засеянные пробирки помещают в термостат при температуре 42-43 °С на 24 ч.
Необходимо описать постановку опыта и зарисовать схему посева исследуемого объекта. Анализ результатов выполняется на следующем занятии. Для этого необходимо просмотреть пробирки со средой Кесслера и выявить рост и газообразование (о развитии бактерий судят по помутнению и изменению окраски среды; о способности к газообразованию судят по накоплению газа в поплавке), затем отметить тот наименьший объем (или массу) исследуемого материала, который вызвал указанные изменения среды. Это будет титр кишечной палочки. Если газообразование не будет наблюдаться, то титр устанавливают условно по помутнению среды.
После установления титра следует провести высев из пробирок с забродившей средой в чашку Петри на плотную питательную среду Эндо, чтобы проверить, кишечная ли палочка вызвала брожение, так как подобные изменения в среде могут вызвать и некоторые другие бактерии.
Среда Эндо является дифференциально диагностической, т. е. на этой среде по характеру роста можно отличить кишечную палочку от других бактерий. В состав среды Эндо входят мясо-пептонный агар, лактоза, фуксин и серно-кислый натрий.
Среду Эндо готовят следующим образом: к, 100 мл стерильного мясо-пептонного агара, имеющего рН 7,6-7,8, добавляют (соблюдая стерильность) 1 г химически чистой лактозы, растворенной в 5 мл стерильной воды, подогретой на водяной бане при температуре 100 °С в течение 5 мин.
В пробирку наливают 0,5 мл отфильтрованного 10 %-ного спиртового раствора основного фуксина, добавляют туда свежеприготовленный 10%-ный водный раствор сернистокислого натра до получения бледно-розового окрашивания. Эту смесь осторожно, не допуская вспенивания, вносят в расплавленный агар с лактозой и разливают в чашки Петри по 6-10-мл.
Можно использовать и готовую сухую среду Эндо, реализуемую в магазинах лабораторных сред.
Перед посевом дно (с внешней стороны) чашки Петри со средой Эндо следует расчертить (тушью или восковым карандашом) на столько участков-секторов, сколько забродило пробирок. Секторы пронумеровать и на поверхность среды Эндо высеять забродившую жидкость из соответствующих пробирок при помощи бактериологической петли штрихом: на сектор № 1 — из первой забродившей пробирки, на сектор № 2 — из второй и т. д. На боковую стенку крышки наклеить этикетку с указанием группы и фамилии студента.
Чашку с засеянной средой Эндо поместить в термостат при температуре 37 °С на 24 ч. Через сутки ее необходимо просмотреть и описать выросшие колонии. Отметить наличие или отсутствие типичных для кишечной палочки колоний, имеющих темно-красный или красный цвет с золотистым металлическим блеском (иногда он бывает выражен слабо). Образование таких колоний происходит вследствие того, что кишечная палочка сбраживает лактозу с выделением уксусного альдегида. При взаимодействии уксусного альдегида с находящейся в среде Эндо фуксинсернистой кислотой выделяется свободный фуксин.
Наличие таких колоний подтверждает присутствие в соответствующей пробе кишечной палочки. Полученные результаты сравнивают с требованиями соответствующих ГОСТов.
