4.3.1. Твердость и физиологические факторы
Яблоки, обработанные 1-метилциклопропеном (МЦП), ингибирующим действие этилена, размягчаются медленнее и по сравнению с необработанными яблоками характеризуются пониженной концентрацией этилена. Твердость яблок, обработанных МЦП повторно во время хранения, выше, чем у яблок, обработанных однократно сразу же после сбора [51]. Было показано, что этилен необходим для продуцирования полигалактуроназы (ПГ) даже на поздней стадии созревания [29]. МЦП-обработка плодов томатов замедляет развитие цвета, размягчение и продуцирование этилена от технической до потребительской стадий зрелости. МЦП оказывает тормозящее воздействие на созревание, продолжающее 5-7 дней, даже на поздних стадиях зрелости, и этот эффект можно продлить путем дополнительной обработки [30]. Тот факт, что МЦП может применяться для замедления созревания на различных стадиях зрелости и он не отнесен к токсическим веществам, делает этот метод привлекательным для ето дальнейшего совершенствования и применения на практике. МЦП уже одобрен Управлением по охране окружающей среды и поступает на рынок под маркой Smart Fresh, Еще один метод повышения твердости и сохранения цвета томатов предложен в работе [46] и заключается в обработке томатов определенной дозой ультрафиолетового излучения. Это позволяет на 7 сут задержать климактерическую реакцию, сопровождавшуюся снижением интенсивности дыхания и продуцирования этилена. Замедление развития цвета и размягчения в данном случае приписывается поддержанию высокого уровня путресцина, физиологическая функция которого противоположна этилену.
Упаковка плодов с использованием РГС, обеспечивающая повышенную концентрацию в упаковке диоксида углерода и пониженное содержание кислорода и этилена, может замедлять потерю качества в послеуборочный период у широкого спектра продуктов [37]. Изменение состава газовой среды зависит от проницаемости упаковочной пленки, интенсивности дыхания, характеристик диффузии газа и состава среды внутри упаковки. При использовании газовой среды с различными характеристиками отмечается тесная взаимосвязь между скоростями размягчения и газообмена яблок сорта Braebuhr [28]. Это свидетельствует о том, что размягчение фруктов непосредственно (метаболически) связано с газообменом. Применение упаковки с РГС в сочетании с абсорбентом (природной глиной), поглощающим воду и летучие вещества, улучшает характеристики твердости малины по сравнению с использованием упаковки только с РГС [86].
4.3.2. Твердость и генетические факторы
Плоды обычно подразделяют на климактерические (характеризующиеся повышенными интенсивностью дыхания и биосинтезом этилена) и неклимактерические (без биосинтеза этилена). Хотя последние могут реагировать на этилен, для их созревания этилен не требуется. И наоборот, этилен необходим для координации и завершения созревания климактерических фруктов. Это было продемонстрировано при изучении трансгенных (климактерических) томатов с заблокированным синтезом этилена. Этилен синтезируется из S-аденозил-L-метионина при участии двух ферментов – АСС-синтетазы и АСС-оксидазы. Снижение продуцирования этилена в процессе созревания приводит к подавлениюантисмысловых линий АСС-синтетазы и АСС-оксидазы [55]. Прямая корреляция между твердостью и образованием этилена была установлена после обнаружения в томатах мутации Nr (от Never ripe – букв, «никогда не созревающий»). У арабидопсиса (Arabidipsis) клонированный ген Nr кодирует белок гомологично рецептору этилена (ETR1), но в нем отсутствуют домен реагирующего регулятора, обнаруженный в ETR1, и связанные транспортеры сигнала. Замена всего лишь одной аминокислоты, экспрессированная в трансгенных растениях, обеспечивает томатам нечувствительность к этилену [94].
У томатов мутант Nrотносят к классу одногенных мутаций. Мутанты rin (ripening inhibitor, «ингибитор созревания»), nor (поп-ripening, «не созревающий»), Nr и Cnr (colorless non-ripening , «бесцветный не созревающий») изучены достаточно хорошо. Мутанты rinу плодов и мутанты nor у томатов не способны синтезировать этилен и не созревают даже в случае его экзогенного применения. Тем не менее, при экзогенном применении этилена наблюдаются некоторые проявления чувствительности к этилену, включая индицирование генов, им регулируемых [97]. Таким образом, возможно, что некоторые процессы созревания протекают независимо от этилена. Мутации rin и nor представляют гены, работающие в начале пути биосинтеза этилена. Ген, соответствующий мутации rin, был клонирован, и оказалось, что созревание контролируется, в частности, транскрипционным фактором, расположенным в MADS-боксе (регуляторном участке ДНК) [52]. Представляет интерес тот факт, что гомолог RIN-гена выделен и в землянике, неклимактерическом растении, что дает возможность предположить наличие общего механизма регуляции созревания у всех плодов [92]. Мутации rin и nor широко использовались для создания гибридов томатов с улучшенными показателями твердости [74]. Мутант Спr характеризуется твердыми плодами со значительно пониженным межклеточным сцеплением (что проявляется их в рыхлой текстуре) и полным отсутствием биосинтеза каротиноидов [17]. Рыхлость фенотипа Спr отражает значительные изменения в структуре клеточных оболочек перикарпия (околоплодника) и специфические изменения в структуре пектина [56]. По-видимому, изменения, происходящие в ходе созревания Сnr-плодов, приводят к дефициту пектинов, поперечно-связанных кальцием, что влияет на способность поддерживать межклеточное сцепление. Клетки зрелых Сnr-плодов не разрываются, а отделяются по срединной ламелле, что и формирует рыхлую структуру [75].
Исследования трансгенных плодов дают ценную информацию о значимости определенных ферментов с точки зрения их вклада в формирование твердости. Очень важной областью, от которой зависит сохранение межклеточного сцепления и «упаковка» клеток в плодовых тканях является срединная ламелла, основными компонентами которой являются пектиновые полимеры [91]. Размягчение обычно связывают с увеличением содержания водорастворимых пектинов в начальной стадии созревания. Ранее считалось, что ферментом, регулирующим растворимость пектинов и, следовательно, размягчение, является полигалактуроназа. Электронная микроскопия показала, что обработка неспелых плодов полигалактуроназой вызывает разрушение срединной ламеллы, подобное наблюдаемому в спелых яблоках [2]. Тем не менее изоляция генов и изучение функциональных характеристик полигалактуроназы в трансгенных томатах (мутантов rin) свидетельствуют о том, что для инициации размягчения одной полигалактуроназы недостаточно, и, по-видимому, в этом процессе участвуют дополнительные факторы [23]. В метаболизм клеточных стенок вовлечен другой фермент, пектинметилэстераза, который может либо повышать доступность полигалактуроназы для ее пектинового субстрата [91], либо вызывать деэтерификацию областей высокометоксилированных пектинов, что может проявляться в их набухании и растворении [98]. Антисмысловое подавление пектинметилэстеразы плодов томатов приводит к снижению расщепления пектинов, но происходящее при этом подавление полигалактуроназы не меняет дополнительных характеристик созревания, в том числе размягчение [80]. Роль дополнительных ферментов в яблоках рассматривалась в работе [35], но, по-видимому, ни один из них не является специфическим для размягчения. Во многих модификациях клеточных стенок в ходе созревания участвуют экспансины – белки, способные ослаблять клеточные стенки [12]. Были выделены гены экспансинов томатов и земляники, регулируемые в ходе созревания плодов в начале пути биосинтеза [11, 68]. Подавление в томатах специфичного к созреванию плодов экспансина Ехр1, приводит к снижению размягчения, а суперэкспрессия – к его повышению, включая размягчение уже сформированных зеленых плодов [4]. Трансгенный сайленсинг гена экспансина LeExp1 проявлялся в большей твердости плодов томатов. При подавлении экспрессии LeExp1 не отмечается изменений размеров плодов и их количества на растении, а срок хранения увеличивается на 5-10 сут [5]. В регулировании активности ферментов, модифицирующих клеточные стенки, участвуют GTP-азы. Плоды антисмысловых томатов меняют цвет обычным образом, но не способны нормально размягчаться. Это сопровождается снижением содержания в клеточных стенках двух гидролаз – пектинэстеразы и полигалактуроназы [45].
В мягких плодах (например, в землянике) полигалактуроназа присутствует в едва различимых количествах [54], и более важную роль в размягчении играют такие ферменты, как пектатлиаза. У трансгенных растений с внедренной антисмысловой последовательностью гена пектатлиазы земляники под контролем промотора 35S отмечено пониженное размягчение плодов [34]. В случае трансгенных растений анализ in vitro свидетельствует о меньшем набухании и пониженном количестве ионосвязанных пектинов. Относительно недавно были выделены два клона (гена) пектатлиазы земляники [3]. Атмосфера, обогащенная СО2, способствует твердости плодов земляники [77]. Интересно, что экспрессия обоих генов пектатлиазы значительно снижает продолжительность послеуборочного хранения ягод при высоком содержании СО2.
Анализ QTL (Quantitative Trait Loci, локусы количественных признаков) позволяет выделить участки генома, влияющие на вариативность признака. Анализ QТL томатов свидетельствует, что вариативность органолептического качества, определявшегося физическими и органолептическими методами, контролируют несколько участков хромосом. Значительное влияние на сочность плодов оказывает участок вблизи локуса Сnr на хромосоме 2 [6]. Генетическая составляющая вариации твердости яблок, измерявшаяся с помощью пенетрометра, и их жесткость (определявшаяся методом акустического резонанса и органолептически) описаны в работе [40]. Измеряемая пенетрометром твердость плода объединяет в себе компрессионную жесткость и сопротивление сдвигу. Это комплексное измерение нашло отражение в анализах QTL, где значимые показатели QTL наблюдаются для трех групп сцеплений из предварительно подготовленной их карты [47]. Высоко значимый показатель QTL выявлен для степени хруста, сочности, рыхлости (пористости) и общей приемлемости. Последующие исследования подтвердили, что этот единственный значимый показатель QTL имеет высокую степень корреляции с сочностью и хрустом плода [41].