Для оценки степени окисленности образцов пищевых продуктов или масел можно использовать несколько методов. Ниже мы рассмотрим основные принципы, лежащие в их основе.
7.3.1. Органолептическая оценка
Для пищевой промышленности обнаружение окисленных посторонних привкусов и запаха – определяющий способ принятия решения о том, что продукт не пригоден для употребления. Индивидуальные способности отдельных людей описывать природу аромата очень полезны, и чувствительность экспертов, прошедших специальную подготовку, к посторонним привкусам позволяют выявлять окислительную порчу намного раньше, чем с помощью химических методов (например, измерения перекисных чисел). Основная проблема органолептических методов оценки качества продуктов состоит в индивидуальных различиях экспертов по чувствительности к посторонним привкусам. Эффективность труда специалистов-экспертов во многом зависит от состояния их здоровья и других причин. Подготовленные дегустаторы значительно надежнее, чем необученные, но по условиям воспроизводимости результатов органолептический анализ обычно уступает химическим или инструментальными методам.
7.3.2. Анализ газовой среды над продуктом (ароматография)
Несмотря на то, что летучие продукты распада липидов составляют лишь малую долю продуктов окисления, именно они воспринимаются потребителем как посторонние привкусы. Поэтому вполне естественно стремление контролирующих органов отслеживать образование летучих продуктов окисления, чтобы иметь в распоряжении инструментальный метод анализа, результаты которого коррелируют с потребительским восприятием степени окисленности липидсодержащих продуктов. Применимость метода к данному объекту исследования обычно определяется корреляцией между органолептической оценкой степени окисленности продукта и содержанием конкретного ароматического вещества или общим содержанием летучих соединений. Здесь следует помнить о том, что аромат образца формируют множество различных веществ, которые отличаются по своему вкладу в общий аромат продукта. Это объясняется различными пороговыми значениями вкусового восприятия и зависимостью аромата от концентрации того или иного вещества (см. табл. 7.1). Тем не менее анализ летучих веществ широко используется как метод мониторинга окислительной порчи образцов масел. Пыли разработаны несколько конкретных прикладных методик, с которыми мы познакомимся ниже.
Статический ароматографический анализ
Масса каждого отдельного компонента газовой среды в герметично закрытой емкости с образцом зависит от давления пара чистого компонента, температуры образца и концентрации этого компонента в образце. Отбор пробы производят с помощью специального газового шприца и вводят ее в колонку газового хроматографа. В этом случае, однако, возникают проблемы, связанные с адсорбцией микрокомпонентов, конденсацией летучих соединении в шприце и их утечкой во время «закалывания» в колонку. Поэтому для отбора проб газовой среды обычно используют специальные автоматические инжекторы. В типичном промышленном анализаторе газовой среды над продуктом образец помещают в стеклянные бюксы, которые снабжены мембраной для отбора проб и винтовой алюминиевой крышкой. Эти бюксы помещают в автоматический термостатируемый пробоотборник. Во время анализа игла пробоотборника прокалывает мембрану бюкса. Перед инжекцией в бюксах создается на некоторое время избыточное давление для выравнивания давления в пробе и в головке колонки. Газ-носитель подается в колонку, затем электромагнитный клапан отключает его подачу, давление в головке колонки падает, и проба исследуемого образца из иглы пробоотборника поступает на колонку. После некоторого периода инжекции, который обычно длится 5 с, восстанавливается подача газа-носителя, инжекция проб прекращается, а игла инжектора извлекается из бюкса.
При анализе этим методом летучих веществ пищевого масла применяют температуры в диапазоне 40-180°С. При температурах выше 150°С происходит разложение гидропероксидов, и состав исследуемых летучих веществ газовой среды определяют летучие вещества, изначально присутствовавшие до анализа, и те, которые образовались в результате разложения гидропероксидов. Даже при достаточно низкой температуре (до 90°С) в течение периода установления равновесия происходит частичное разложение гидропероксидов. Для этого обычно требуется 10-20 мин. Статический анализ газовой среды над продуктом – относительно быстрый и простой метод, который не требует использования растворителей. Он менее чувствителен, чем динамический анализ газовых сред, и позволяет выявлять главным образом самые летучие вещества, тогда как динамический анализ позволяет идентифицировать вещества в широком диапазоне их летучести. Для проведения мониторинга окислительной порчи пищевого масла, содержащего линолевую кислоту или другие полиненасыщенные жирные кислоты с п-6-структурой, измеряют концентрацию гексаналя и пентаналя пли общее содержание летучих соединений. Пропаналь, 2-гексеналь, 3-гексеналь и 2,4-гентадиеналь образуются из α-линоленовой кислоты или других полиненасыщенных жирных кислот с п-3-структурой.
Еще одним способом статического анализа газовой среды над продуктом является микроэкстракция твердой фазы (Solid Phase Micro Extraction, SPME). В этом методе используется специальный шприц с кварцевым стекловолокном с покрытием из полимерной газохроматографической неподвижной фазы (например, полидиметилсилоксана). Волокно с покрытием защищено подвижным игольным стержнем, который прокалывает мембрану бюкса во время отбора проб. Затем игольный стержень извлекают, освобождая волокно с полимерным покрытием и обеспечивая ему контакт с пробой. После достижения равновесного состояния или после истечения заданного времени волокно снова экранируют игольным стержнем. Затем шприц извлекают и переносят в инжекторный порт газового хроматографа. После прокалывания мембраны колонки волокно освобождается, анализируемые вещества термически десорбируются и вводятся в колонку газового хроматографа.
Преимуществом метода SPME является легкость и быстрота исполнения – для улавливания летучих веществ необходимо около 30 мин. При этом не требуется капитальных затрат, поскольку не используется никаких специальных инжекторов. Вместе с тем этот метод менее чувствителен, чем другие методы анализа газовой среды над продуктом. Кроме того, кварцевое стекловолокно – материал достаточно хрупкий и нуждается в периодической замене.
Динамический ароматографический анализ
Альтернативный метод анализа летучих соединений – динамический ароматографический анализ – включает в себя продувку образца азотом или гелием в течение периода постоянного улавливания летучих веществ. Летучие вещества задерживаются пористым полимерным уловителем (например, ТепахТМ) при комнатной температуре. Наиболее распространенным способом введения летучих веществ в колонку газового хроматографа является совмещение уловителя с входным отверстием газового хроматографа и его последующее нагревание для. десорбции летучих веществ. Экстракция растворителем летучих веществ из уловителя и инжекция экстракта используется в качестве альтернативной процедуры пробоотбора, но такой способ значительно менее чувствителен, чем термическая десорбция. Динамический ароматографический анализ позволяет обнаруживать компоненты в более широком диапазоне летучести по сравнению со статическим методом. Его недостатком являются потери слабоадсорбированных компонентов через уловитель еще до окончания периода улавливания.
Прямая инжекция
Метод прямой инжекции основан на размещении образца у входного отверстия колонки газового хроматографа с последующим его обдувом газом-носителем (для переноса летучих веществ на колонку, предварительно охлажденную для обеспечения большей эффективности процесса улавливания). Этот метод позволяет улавливать летучие вещества в широком диапазоне их летучести, однако используемый при этом образец продукта значительно меньше по размеру и массе по сравнению с возможными размером и массой образцов при динамической ароматографии. Метод прямой инжекции применяется непосредственно для масел, тогда как статический и динамический методы ароматографии – для многокомпонентных систем.
7.3.3. Перекисное число
Измерение перекислено числа (ПЧ) остается самым распространенным химическим методом оценки окислительной порчи масел. Хотя продуктами разложения гидропероксидов являются смеси летучих и нелетучих веществ, которые в дальнейшем вступают в реакции с эпдопероксидами и другими продуктами окисления, измерение ПЧ является полезным методом контроля окислительной порчи. Как правило, этот метод должен сочетаться с другими методами мониторинга образования вторичных продуктов окисления, так как в этом случае можно получить более полную картину процесса окисления. Высокие значения ПЧ свидетельствуют либо о высокой скорости образования гидропероксидов, либо о низкой скорости их разложения. Следовательно, если для повышения стабильности масла используют антиоксиданты, то по оценке ПЧ эффект их действия не всегда можно зафиксировать.
Традиционный метод определения ПЧ включает титрование проб масла, содержащего йодид калия, в смеси хлороформ-уксусная кислота. Гидропероксиды окисляют йодид до молекулярного йода, который оттитровывают тиосульфатом натрия. Чтобы отказаться от использования хлороформа, был разработан альтернативный метод, в котором в качестве растворителя применяют изооктан, однако этот метод используется в том случае, если ПЧ не превышает 70 ммоль/кг [1].
Значение ПЧ, при котором в исследуемом образце обнаруживается посторонний привкус, колеблется в широких пределах в зависимости от природы масла. Прогорклость оливкового масла не ощутима, пока ПЧ не достигнет 20 ммоль/кг, тогда как в рыбьем жире посторонний привкус может развиться уже при ПЧ < 1 ммоль/кг.
7.3.4. Диеновые конъюгаты
Образование гидропероксидов из полиненасыщенных жирных кислот приводит к конъюгации пентадиеновой структуры. Продукты конъюгации поглощают ультрафиолетовое излучение при длине волны 233-234 нм, что даст возможность просто и быстро осуществлять контроль окислительной порчи масла. Хотя светопоглощение является, в основном, показателем содержания гидропероксидов, некоторые продукты, образующиеся после их разложения (например, 9-гидроксиоктадека-10,12-диеновая и 13-гидроксиоктадека-9,11-диеновая кислоты), сохраняют сопряженную структуру и будут оказывать влияние на интенсивность светопоглощения. Следовательно, данный метод является менее селективным, чем измерение перекисного числа.
7.3.5. Пара-анизидиновое число
Пара-анизидин реагирует с альдегидами, образуя при этом продукты, которые поглощают УФ-излучение с длиной волны 350 нм. р-Анизидиновое число определяется как значение оптической плотности раствора, образующегося в результате реакции 1 г масла в изооктане (100 мл) с р-анизидином (0,25% в ледяной уксусной кислоте). Продукты, образующиеся в результате реакции с ненасыщенными альдегидами (2-алкеналями), сильнее поглощают УФ-излучение с этой длиной волны, и поэтому данный тест особенно чувствителен по отношению к этим продуктам окисления. Тест не позволяет различать летучие и нелетучие продукты окисления, однако рецепторы человека обычно более чувствительны к ненасыщенным летучим альдегидам. Таким образом, данный тест считается вполне приемлемым для оценки вторичных продуктов окисления. Определение р-анизидинового числа, как правило, сопровождается параллельным анализом перекисного числа для описания общей степени окисленности жира (Totox-число). Последнее вычисляют по сумме р-анизидинового и удвоенного значения перекисного числа. Вместе с тем, То1ох-число – всего лишь безразмерный эмпирический параметр, полученный в результате суммирования двух других, каждый из которых имеет различные единицы измерения.
7.3.6. Тиобарбитуровое число
Малоновый диальдегид (МДА) образуется из полиненасыщенных жирных кислот, имеющих в молекулах не менее трех двойных связей. Содержание этого продукта можно оценить по его реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой (2-ТБК), в результате которой образуются конденсированные продукты, окрашенные в красный цвет и характеризующиеся светопоглощением при длине волны 532-535 нм с молярным коэффициентом поглощения 27,5 ед. опт. плотности/мкмоль. Эта реакция неспецифична, и поэтому на интенсивность светопоглощения могут оказывать влияние реакции 2-ТБК со многими другими веществами. В частности, 2,4-алкадиенали (например, 2.4-декадиенали) также вступают в реакцию с 2-ТБК и характеризуются сильным светопоглощением при длине волны 532 нм. Насыщенные альдегиды вступают в реакцию с 2-ТБК и обычно поглощают свет при более низких длинах воли. Кроме того, на определение концентрации МДА влияет ряд пищевых компонентов, включая белки, продукты реакции Майяра и продукты расщепления сахаров. Чтобы подчеркнуть недостаточную специфичность этого теста, результаты, полученные врезультате его применения, обычно обозначают как TBARS (ТВА Reactive Substances, химически активные в реакции с 2-ТБК). Подробнее о 2-ТБК-тесте см. [5].
7.3.7. Октаноатное число
Октаноатное число является показателем присутствующего в масле связанного октаноата. Октаноат образуется при разложении 9-гпдропероксида линолевой кислоты [8]. Данный метод включает транс-метилирование с помощью основания (например, метилата натрия) и последующий газохроматографический анализ образующегося метилоктаноата.
7.3.8. Сопряженные продукты окисления
Анализ сопряженных (конъюгатных) продуктов окисления основывается на том факте, что гидропероксиды, образующиеся из полиненасыщенных жирных кислот, и некоторые продукты их разложения восстанавливаются с помощью борогидрида натрия и дегидрируются с образованием триенов и тетраенов [7]. Содержание триенов и тетраенов определяется спектрофотометрическим методом при длинах волн 268 и 301 нм соответственно.
7.3.9. Инфракрасная спектроскопия
Инфракрасная спектроскопия с использованием преобразования Фурье (ИСПФ, FTIR, Fourier Transform Infrared Spectroscopy) – весьма перспективный метод для анализа гидропероксидов в маслах. Определенный прогресс в анализе содержания гидропероксидов и других продуктов окисления был достигнут при непосредственном их определении в маслах авторами работы [9]. Этот метод включает калибровку по известным эталонам и является актуальным в силу своей экспрессности и отсутствия необходимости использовать для проведения анализа реактивы. Следует отметить, однако, что добавление в масло, содержащее гидропероксиды, трифенил-фосфина (ТФФ) позволяет повысить избирательность и точность метода [6]. Это приводит к образованию трифенилфосфиноксида (ТФФО) с интенсивной полосой поглощения при 542 см-1. В работе с описанием этого метода перекисное число определялось в диапазоне 0-15 ммоль/кг, при этом в качестве эталона для калибровки использовался ТФФО. Калибровочный график во всем исследовавшемся диапазоне представлял собой прямую линию. Методика анализа включала добавление 33% масс. исходного раствора ТФФ в гексаноле (0,2 г) к образцу расплавленного жира или масла (30 г). Смесь встряхивают и переносят в 100-микрометровую инфракрасную измерительную кювету, в которой поддерживается температура 80°С. Реакция и ИСПФ-аиализ одного образца занимает в целом около 2 мин. Для проверки метода проводили сравнение результатов, полученных с помощью автоматизированной ИСПФ-процедуры и титриметрическим методом определения перекисших чисел по стандартной американской методике (AOCS). Проверку проводили на образцах окисленных масел и образцах масел, обогащенных трет-бутил-гидропероксидом. По воспроизводимости результатов ИСПФ-метод превосходит стандартные химические методы.
