8.3.1. Молоко и молочные продукты
Сырое молоко содержит липопротеинлипазу и сложную смесь жирных кислот, этерифицированных преимущественно в триацилглицеридах. Этот «молочный липид» состоит из 2,6-6% молока и свыше 80% масла [84]. Образующиеся в результате гидролиза масляная (С4 : 0) и капроновая (С6 : 0) кислоты, этерифицированные с sn-3 атомом углерода, являются летучими и вызывают неприятный привкус (соответственно, вкус прогорклости и ноты «козьего» запаха). Тем не менее, несмотря на присутствие липопротеинлипазы, прогорклость лишь в незначительной степени индуцируется липолизом, так как жировые шарики молочного жира защищены мембраной [38]. Эта мембрана состоит из глицеролипидов, фосфолипидов, холестерина и его эфиров, свободных жирных кислот, сквалена, каротиноидов и некоторых протеинов [26]. Чтобы активировать липазу, необходимо связать ее с межфазным пограничным слоем. Для этого требуется апопротеин ароС11, который «стыкует» фермент с частицей субстрата в нужной стерической конфигурации. Этот апопротеин присутствует в сыворотке, но отсутствует в молоке. Тем не менее, любой фактор, действие которого изменяет или разрушает межфазный слой и нарушает структуру жировых шариков (например, механическое перемешивание в ходе доения, сбивание масла или сливок и т. д.), может привести к началу липолитической порчи, вызванной нативными ферментами, присутствующими в сыром молоке. Эти факторы необходимо принимать во внимание при внесении изменений в технологию молочного производства.
Липопротеинлипаза, выделенная в виде белка 62-66 kDа [33], денатурирует при 55-60°С. Таким образом, она успешно инактивируется термообработкой – например, пастеризацией при 72°С (липолиз может также происходить в результате микробиологической контаминации после тепловой обработки). Сепарирование сливок, приводящее к удалению жировых шариков, делает окислительную прогорклость менее вероятной.
В козьем молоке и молочных продуктах из него система липолитических ферментов играет важную роль в формировании характерного «козьего» привкуса. Несмотря на более низкие уровни содержания липопротеинлипазы, скорость липолиза в них выше. Это обусловлено тем, что в козьем молоке с жировыми шариками связано больше фермента, чем в коровьем [23].
Липолиз может играть определенную роль в формировании вкуса сыра. Если используется пастеризованное молоко, липазу добавляют в процессе созревания сыра. При использовании сырого молока нативная липаза, присутствующая в молоке или твороге, теряет свою липолитическую активность в процессе созревания вследствие ошпаривания творога, удаления сыворотки и снижения рН, но несмотря на это свежие или мягкие сыры могут портиться [50]. При производстве мягких сыров обезжиренное молоко также восстанавливают с помощью ненасыщенных жиров, полученных, например, из овощей. При решении вопросов, связанных со сроками хранения сыров, необходимо принимать во внимание как липолиз, так и окислительную стабильность добавленной липидной фракции [27, 47].
При производстве мороженого, масла и других продуктов с измененными свойствами (плавление и т. д.) молочный жир модифицируют. Коровье молоко характеризуется низким содержание С18-полиненасышенных жирных кислот (С18 : 2, С18 : 3 обычно составляют 1-3% в зависимости от сезонных колебаний). Это объясняется тем, что микроорганизмы в рубце коров такие кислоты перед адсорбцией частично гидрогенизируют. Тем не менее, биологическую гидрогенизацию можно преодолеть (например, добавляя в корм капсулированные полиненасыщенные жирные кислоты) и поднять содержание С18 : 2 до 35%. При этом, однако, при хранении продуктов переработки такого молока возникают проблемы, связанные с их окислительной стабильностью [32].
Предотвратить появление кислого привкуса позволяет добавление в свежее молоко α-токоферола, диетические добавки которого не только повышают окислительную стабильность молока, но и помогают также ингибировать окислительное действие примесей меди [22].
8.3.2. Мясо и мясные продукты
Окисление липидов – важный фактор ухудшения качества мяса и мясных продуктов [64]. По мере старения мяса в нем увеличивается содержание свободных жирных кислот [111]. Этот показатель, по-видимому, является ключевым и влияет на процесс сухого созревания ветчины, в котором фосфолипазы считаются ответственными за потерю фосфатидилхолина и фосфатидилэтаноламина [56, 109].
Природа и степень липолиза по всей видимости зависит от типа метаболизма мышечной ткани, обусловленного содержанием субстратов и ферментов. Это связано с различиями в окислительной активности мышечной ткани и в эффективности посмертной мобилизации липидов из жировых отложений, хотя иногда более важным фактором формирования окислительной прогорклости является распад фосфолипидов.
Результаты изучения мышечной ткани различной морфологии свидетельствуют, что красная (окислительная) мышечная ткань по сравнению с белой (гликолитической) характеризуется более высоким содержанием фосфолипидов (и, следовательно, содержанием полиненасыщенных жирных кислот), а также повышенной активностью фосфолипазы и липазы [55]. Содержание полиненасыщенных жирных кислот возрастает с увеличением окислительной активности мышц.
Эксперименты с белой мышечной тканью (свиная мышца Longissimiis dorsi в вакуумной упаковке при хранении при -18°С в течение 6 мес.) показали, что образование свободных жирных кислот полностью объясняется фосфолипазной активностью на фосфолипидах, учитывая убыль линолевой кислоты (С18 : 2) из фосфатидилэтаноламина без каких-либо изменений во фракции насыщенных жирных кислот. С этой тенденцией согласуются данные работы [4], свидетельствующие, что в белой
мышце кролика фосфолипиды – более важный источник свободных жирных кислот, чем триацилглицериды, а в красной мышце триацилглицериды обеспечивают такое же или более высокое содержание свободных жирных кислот, чем фосфолипиды. Это отражает состав метаболических ферментов в мышцах различной морфологии, поскольку красная (окислительная) мышечная ткань, богатая железосодержащими ферментами, лучше приспособлена к извлечению энергии из жировых отложений, а белая (гликолитическая) ткань – из глюкозы. Подобное наблюдается при хранении мяса индейки [106], в котором окисление в бедренных мышцах заметнее по сравнению с грудными; авторы объясняют это более высоким содержанием фосфолипидов и полиненасыщенных жирных кислот.
Важным фактором окислительной стабильности является также эффективность присутствующих в красной мышечной ткани железосодержащих протеинов в активизации окисления. Тем не менее, более вероятно, что красное мясо и продукты, выработанные из этой мышечной ткани, сильнее подвержены окислительной прогорклости, чем белое мясо и продуктами его переработки (см. также [100]).
Мясо птицы (цыплята, индейки и т. д.) содержит по сравнению с красным мясом полиненасыщенные жирные кислоты в более высоких пропорциях, но при этом под кожей птиц находится больше жира, чем в мясе [98]; подкожный жир легко удаляется. В вареных грудках цыпленка жира 1,3%, тогда как в говядине – 13-30% [79]. О содержании ненасыщенных жирных кислот в жировой ткани жвачных животных см. [15].
К липолитическим ферментам, присутствующим в жировой ткани, относятся липопротеинлипаза, гормоночувствительная липаза (гидролизующая триацилглицериды до диацилглицеридов) и моноацилглицеридлипаза [109]. Поскольку некоторые изменения в жировой ткани регулируются гормонами, то физиологическое состояние и степень упитанности животного перед забоем влияет на качество получаемого мяса и его стабильность при хранении.
Как и в случае молока, обогащение кормов ненасыщенными жирными кислотами влияет на жирность мяса различных отрубов. Содержание жира в мясе зависит также от породы животного [10]. Добавление витамина Е препятствует развитию окислительных реакций хранившегося мяса и повышает его пищевую ценность [49, 63, 65, 95].
8.3.3. Рыба
Липиды рыб отличаются от липидов большинства других животных составом высокомолекулярных жирных кислот – степень ненасыщенности их выше. Полиеновые кислоты образуются в фитопланктоне и водорослях, находящихся в основании пищевой цепи морской фауны. Две основные жирные кислоты – эйкозапентаеновая (С20 : 5 n-3) и докозагексаеновая кислота (С22 : 6 n-3) – считаются полезными для здоровья, поскольку снижают риск развития сердечнососудистых заболеваний и атеросклероза [9, 30, 31], однако ненасыщенная природа липидов оказывает при автолизе негативное влияние на окислительную стабильность.
Появление «картонного» привкуса в замороженной треске связано с действием гепт-цис-4-еналя [53], а из эйкозапентаеновой кислоты образуется 2-транс-4-цис-7-цис-декатриеналь, усиливающий рыбный запах [76].
Имеются данные, что в замороженном лососе свободные жирные кислоты сами по себе имеют определенный привкус, а вместе с докозагексаеновой, пальмитолеиновой, линолевой и эйкозапентаеновой кислотами, высвобождаемыми из триацил-глицеридов, они обусловливают вкус ворвани, горечь и металлический привкус [92]. Существует мнение, что свободные жирные кислоты участвуют в образовании перекрестной сшивки протеинов [29, 52], что оказывает негативное влияние на текстуру мышечной ткани рыбы. Считается, что свободные жирные кислоты в рыбе являются субстратами окисления, хотя по атому поводу существуют разные точки зрения [69, 102].
В работе [16] изучалось распределение липидов в различных анатомических частях жирной рыбы (австралийской скумбрии и макрели). В темном мясе (0,5 см под кожей), составляющем 20% от массы филе, содержится 20% липидов, а в белом мясе (80% от массы филе) – 4%. Белое мясо в два раза богаче фосфолипидами, чем темное (19 и 10% соответственно). Примерно такое же соотношение наблюдается в отношении п-3 жирных кислот – эйкозапентаеновой и докозагексаеновая.
Согласно [18], в замороженной балтийской сельди большая часть (55%) свободных жирных кислот в темном мясе образуется из триацилглицеридов, а белом – в основном из фракции фосфолипидов (75%). Такая же тенденция наблюдается в замороженном тунце [110]. Это напоминает ситуацию с мясом млекопитающих (см. предыдущий раздел), где фосфолипиды являются основным источником свободных жирных кислот в белой мышечной ткани, а красное мясо не уступает белому по интенсивности расщепления резервных триацилглицеридов и фосфолипидов. В случае замороженной балтийской сельди [18] триацилглицериды темного мяса более активны в отношении гидролиза, так как начальные уровни содержания липидов и скорость их гидролиза в темном мясе выше, чем в белом. Содержание свободных жирных кислот в темном и светлом мясе после 12 недель хранения при -15°С составляет 1000 мг/100 г и 280 мг/100 г соответственно, но здесь все не так просто, как кажется на первый взгляд. В замороженной молочной рыбе (белянке), другом представителе семейства сельдевых, гидролиз нейтральных липидов происходит только после гидролиза фосфолипидов. В замороженном филе трески (постной рыбы, которая, как считается, не создает особых проблем с прогорклостью) свободные жирные кислоты образуются только из фосфолипидов. [53]
Прогорклость присуща лишь жирной рыбе – сельди, лососю, сардинам, менхадену (американской сельди) и т. д. с содержанием липидов более 5% от общей массы мяса. Значительные колебания в содержании липидов, доходящем до 25-30%, относят на счет триацилглицеридов. Эти колебания вызываются несколькими факторами – видовой принадлежностью рыбы, особенностями ее рациона, сезонностью лова, полом и т. д. Несмотря на это большинство исследований было посвящено изучению фосфолипидов, хотя, по нашему мнению, изучать следовало бы прежде всего триацилглицериды и липазы.
В триацилглицеридах рыб полиненасыщенные жирные кислоты связаны с sn-2 атомом углерода, насыщенные или мононенасыщенные жирные кислоты – с sn-1, а мононенасыщенные жирные кислоты – с sn-3 атомом [19, 72, 74].
Имеются сведения о выявлении в мясе рыб нескольких триацилглицеридных липаз, но ими оказались низкомолекулярная липаза из скумбрии [45] и высокомолекулярная липаза из радужной форели [12], которые, как было доказано позднее, имеют лизосомальное происхождение и высвобождаются при медленном замораживании и температурных колебаниях при хранении рыбы. Быстрое замораживание и последующее хранение этих видов рыбы при низких температурах снижают вероятность высвобождения липаз [46]. Эти липазы были также частично экстрагированы из жировой: ткани радужной форели [101].
Имеются некоторые данные о том, что липазы мышечной ткани рыб, вовлеченные в мобилизацию резервных триацилглицеридов, чувствительны к воздействию гормонов стресса. Поэтому большое значение для сроков хранения могут иметь состояние упитанности и стресс при вылове [6]. Порчу рыбы могут также обусловливать липазы пищеварительной системы, особенно в случае мелких видов рыб (например, сардин и анчоусов), вследствие их попадания в тканевые структуры при неправильном потрошении или разрыве внутренностей во время транспортировки непотрошеной рыбы. В некоторой степени эту проблему помогает решить низкотемпературное хранение непотрошеной рыбы.
Процентное соотношение эйкозапентаеновой и докозагексаеновой кислот, входящих в состав фосфолипидов, по сравнению с таковыми в триацилглицеридах, больше. Речь идет в основном о sn-2 замещенных фосфатидилхолине и фосфатидилэтаноламине. В рыбе обнаружены обе фосфолипазы А1 и А2, в отличие от фосфодиэстераз PLC и PLD. PLA2 присутствует в ряде видов рыб, как в постных, так и в жирных [6]. Некоторые из них Са2+-зависимы, например, сайда [7], а другие независимы (например, форель) [13]. Известно, что в форели и лососе при воспалительной реакции PLA2участвует в образовании эйкозаноидов [11, 86]. Если проводить параллели с млекопитающими, то повреждение ткани и стресс при вылове повышает содержание этого фермента, что определяет негативные последствия при хранении [6]. Кальций-независимая Р1А1 выявлена в белом мясе тунца и в обыкновенной скумбрии [6, 57]. Фосфолипазная активность в постной рыбе проявляется в том, что в результате взаимодействия свободных жирных кислот и мышечных белков мяса такой рыбы ее текстура становится более жесткой [29, 52, 103].
Кроме реакций, катализируемых ферментами, свой вклад в потерю стабильности при хранении вносит структурная конфигурация жирных полиенацильных радикалов в случае присутствуя в биологических мембранах их этерифицированных форм (например, фосфолипидов). Наличие двойных связей в цис-конфигации затрудняет плотную упаковку ацильных радикалов и влияет на структуру и целостность мембран [99, 112, 113, 118].
При адаптации к холоду насыщенный жирнокислотный остаток в sn-1 положении замещается на ненасыщенный; это, в свою очередь влияет на температуру фазового перехода мембран от жидкокристаллического до гелеобразного состояния. Например, температура (разового перехода у адаптированного к холоду карпа может снизиться с -8 до -13°С [37, 54]. В результате фазовых изменений мембраны могут стать проницаемыми для растворенных веществ, включая Са2+, который играет важную роль в активации некоторых фосфолипаз. В некоторых системах липидная фаза влияет на эффективность связывания липолитического фермента с межфазным слоем, происходящего более активно в гелеобразной фазе, то есть при более низкой температуре [77].
Сравнительная оценка потерь фосфолипидов и триацилглицеридов в замороженном хеке при различных температурах приведена в [24]. Оказалось, что при понижении температуры скорость гидролиза фосфолипидов по сравнению с нейтральными липидами снижается быстрее. Расчеты показали, что при температуре выше -12°С фосфолипиды гидролизуются быстрее, чем нейтральные липиды, а при температуре ниже -12°С быстрее гидролизуются триацилглицериды. Этот факт отражает доступность субстрата, который для фосфолипидов обеспечивается поверхностью бислоя мембраны, тогда как для резервных триацилглицеридов доступны лишь липиды на поверхности жирового шарика. Это ограничивает скорость гидролиза триацилглицеридов, что, в свою очередь, объясняет этот феномен. Интересно, однако, что рассчитанная точка пересечения на графике зависимости скорости гидролиза фосфолипидов и триацилглицеридов от температуры (-12°С) почти совпадает с температурой фазового перехода фосфолипидов рыб (см. выше), когда начинает проявляться действие ряда других факторов. Все это очень важно для рыбы, которая зачастую в течение нескольких суток хранится на льду или замораживается в сыром виде на продолжительный период времени. В работе [24] делается вывод, что притемпературе выше -12°С в постной рыбе формируется более высокое содержание свободных жирных кислот, чем в жирной, и что при температуре ниже -12°С должна наблюдаться обратная картина.
Влияние добавок в рыбный корм ненасыщенных жиров, α-токоферола и астаксантина (встречающегося в природе производного витамина А) на стабильность хранения замороженной радужной форели и охлажденного копченого филе изучалось в работах [62, 66]. Повышение дозировок астаксантина предотвращает окисление липидов в замороженной до -28°С рыбе. В копченом филе при холодильном хранении с температурой 3°С окислению липидов противодействует внесение α-токоферола. При исследовании сроков хранения атлантического палтуса и тюрбо выяснилось, что у палтуса устойчивость к окислению и изменению цвета выше (в нем содержится больше α-токоферола, чем в тюрбо) [94].
