Инструментальные методы разрабатывают в основном для снижения времени тестирования и трудоемкости анализа пищевых продуктов, и их можно отнести к ускоренным методам анализа. Тем не менее скорость анализа зависит от используемых принципов определения микроорганизмов. В случае различных скоростей роста исследуемой культуры продолжительность анализа больше, чем при непосредственном обнаружении клеток или молекул. В качестве примера здесь можно упомянуть турбидиметрические методы оценки мутности, электрометрические методы и методы анализа спектральных характеристик среды. К методам, которые могут применяться без стадии культивации, относятся хемилюминесценция, проточная цитометрия, иммунологические и молекулярные методы (см. [25, 82, 222]. Инструментальные методы используют преимущественно для идентификации и типирования дрожжей (см. об этом раздел 12.4). Иммунологические методы также относятся к инструментальным, хотя их и не всегда можно считать таковыми, поскольку не всегда можно разграничить методы, зависимые и независимые от исследуемой культуры, так как этап культивирования микроорганизмов может являться подготовительной операцией для последующего выполнения хемилюминесцентного анализа, проточной цитометрии, иммунологического исследования или применения молекулярного метода.
12.3.1. Электрометрия
Оценка численности микроорганизмов по электрометрическим методам основывается на изменениях электрических характеристик – импеданса (полного сопротивления), емкости или проводимости культуральной среды, и ее результаты достаточно хорошо коррелируют с чашечным подсчетом. Использование импеданса для оценки численности микроорганизмов с начала 1970-х гг. было ориентировано на клинические исследования [209]. Было установлено, что для подсчета дрожжевых клеток емкостный способ обладает большей экспрессностью по сравнению с методами оценки импеданса [79] или проводимости [79, 193]. Так как этот метод зависит от вида используемой культуры, то скорость анализа определяется степенью начальной контаминации образца и скоростью роста микроорганизмов [29]. На сильно контаминированных образцах и в случае оценки численности бактерий, средние скорости роста которых выше, чем у дрожжей, анализ занимает менее 24 ч [225]. Согласно [101], для дрожжей, вызывающих порчу вина, время обнаружения составляет от 43 ч (при 10 жизнеспособных клетках/мл) до 16 ч (при 105 жизнеспособных клеток/мл). Интенсивность импульса электрического сигнала обусловлена культуральной средой [79, 193] и типом растущих микроорганизмов [101]. В пиве дрожжи вызывают увеличение импеданса, тогда как молочнокислые бактерии – его уменьшение [71]. Это затрудняет интерпретацию результатов при наличии смешанных популяций. Относительно недавно были предложены методики косвенного определения проводимости. Они основаны на измерении выделения СО2, и особенно подходят для анализа напитков [51]. Их можно использовать при разработке систем прогнозирования срока годности пищевых продуктов, поскольку они обеспечивают быстрое (но сравнению с прямым кондуктометрическим методом) обнаружение микроорганизмов благодари пониженным порогам обнаружения (около 104–105 дрожжевых клеток/мл) [49, 51, 52].
12.3.2. Оптические методы
В некоторых методах для обнаружения и определения численности микроорганизмов используются оптические приборы, с помощью которых измеряют изменения цвета питательной среды в результате образования диоксида углерода, изменения рН или окислительно-восстановительного потенциала вследствие протекания в микроорганизмах метаболических процессов [82]. Устройство, разработанное для подсчета бактерий (время получения результата – от 2 до 11 ч), можно использовать и для подсчета дрожжевых клеток в йогурте и мягком сыре после инкубации в течение 40 ч [76]. Скорость тестирования (менее 12 ч) и возможность анализировать санитарные смывы позволяет использовать его в системах НАССР (анализа рисков и критических контрольных точек) [188]. Другие колориметры (например, BacT/Alert Microbial Detection System, Omnispec Bioactivity Monitor System) применяют преимущественно для обнаружения патогенных микроорганизмов в клинических исследованиях [82].
Более сложный оптический метод основан на захвате микроорганизмов в микро-каплях геля (диаметром 10-100 мкм), окруженных гидрофобной жидкостью, с последующим их подсчетом с помощью колориметрических или флуоресцентных индикаторов рН [227]. Он применяется в клинических бактериологических анализах и обеспечивает более высокую скорость получения результатов, чем методы чашечного подсчета. Если в таких микрокаплях способны расти некультивируемые микроорганизмы, то подсчет клеток можно вести и с помощью метода проточной цитометрии [109, 230].
12.3.3. Биолюминесценция
Биолюминесцентные анализы основаны на количественной оценке АТФ (аденозинтрифосфата) клеток с использованием фермента люциферазы и кофактора люциферина. Излучение, образующееся в результате гидролиза АТФ, измеряется люминометром, при этом интенсивность излучения пропорциональна количеству АТФ в образце. Источниками обнаруживаемой АТФ могут быть не только микроорганизмы, но и, например, технологические остатки при производстве пищевых продуктов. При работе с фильтрующимися образцами обнаруживают очень низкие уровни микробиологической контаминации (например, менее 10 дрожжевых клеток/250 мл), однако успехи в применении данного метода в разных отраслях промышленности [89, 123, 124, 143, 199, 205] не привели до сих пор к его широкому внедрению [48]. В настоящее время биолюминесцентный метод больше приспособлен к санитарно-гигиеническому контролю [170] (так как в этом случае отсутствует необходимость проводить различия источников излучения), а также к анализу стерильных продуктов без каких-либо органических остатков. Высокая скорость анализа (несколько минут) делает его перспективным для использования и системах НАССР,поскольку позволяет осуществлять санитарный контроль практически в любой момент времени [40]. В случае если уровень АТФ оказывается выше допустимого, всегда существует возможность повторить мойку или дезинфекцию, однако остатки моющих или дезинфицирующих средств в образце даже в следовых количествах могут повлиять на интенсивность излучения АТФ [90]. Серийно выпускающиеся системы биолюминесцентного контроля отличаются по точности и воспроизводимости результатов измерений [40].
12.3.4. Проточная цитометрия
В проточной цитометрии оценивается количество клеток микроорганизмов, проходящим под лучом лазера. Основным преимуществом этого метода является его чувствительность и скорость, но многие пищевые матриксы, рассеивая свет, создают помехи для его распространения, влияя тем самым на результат. Первые работы в этой области были посвящены возможностям применения данною метода для подсчета дрожжевых клеток в безалкогольных напитках [163] и пиве [108]. В настоящее время проточная цитометрия адаптирована к обнаружению клеток, окрашенных флуорохромами, и стала довольно чувствительной. С ее помощью можно получать информацию в любой момент, и поэтому этот метод является весьма перспективным [222]. Применение флуороцитометрии в виноделии позволяет получить результаты анализа виноградного сока при пороговой численности 5 х 104 дрожжевых клеток/мл [26], а вина – при 103 дрожжевых клеток/мл [133]. Во фруктовых йогуртах этот метод обеспечивает обнаружение ДВПП после 24-часового культивирования при уровне контаминации в 1 дрожжевую клетку на упаковку готового продукта [92]. . Была разработана методика ускоренной оценки срока годности йогуртов, занимающая 48 ч, что значительно меньше обычного ускоренного тестирования срока годности, требующего 7 сут. В работе [187] сообщается об уровне чувствительности обнаружения, а именно 100 жизнеспособных дрожжевых клеток в 1 г готового салата в течение 45 мин или 1 жизнеспособная дрожжевая клетка в 20 г переработанных фруктовых продуктах (после инкубации в течение 48 ч). Учитывая малое время отклика, метод проточной цитометрии можно использовать в активных системах обеспечения качества продукции [26, 92]. Рассматривается также возможность ее использования вместе с флуоресцентными зондами [169].
Относительно новым методом подсчета одиночных клеток является твердофазная цитометрия. После фильтрации образца микроорганизмы метят на мембране флуоресцентным красителем и подсчитывают с помощью лазерного сканирующего устройства [55]. Такая эпифлуоресцентная микроскопия может использоваться для наблюдения случайных флуоресцентных пятен с помощью подвижной платформы, управляемой компьютером [56]. При использовании этого метода для клинических анализов дрожжей Cryptococcus neoformans, меченых иммунофлуоресцентными красителями, пределы обнаружения в течение 30 мин составили 3–6 кл./мл [[16].
12.3.5. Иммунологические методы
Для обнаружения ДВПП применяют также иммунологические методы. Иммунофлуоресцентный метод был адаптирован для нужд пивоваренной промышленности [29] и успешно применяется в промышленных условиях для обнаружения дрожжевых контаминантов, что занимает 2,5 ч [121]. Количественная оценка интенсивности флуоресценции диких пивных дрожжей, обнаруженных иммунофлуоресцентным методом, может быть получена методом проточной цитометрии [105]. Ферментно-опосредованный иммуносорбентный анализ (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA) дляобнаружения Brettanomyces spp. непосредственно в винах при визуальной и спектрометрической оценке результатов описан в работе [114]. Чувствительность такого анализа составляет 91,5 х 10-12 г белка, что в пересчете эквивалентно обнаружению 34 кл./мл вина. Несмотря на эти многообещающие показатели, иммунологические методы до сих пор не нашли широкого применения при обнаружении дрожжей (возможно, из-за отсутствия серийно выпускаемых антигенов) [48]. Последние достижения и перспективные разработки в иммунодетекции и идентификации присутствующих в пищевых продуктах патогенных микроорганизмов весьма далеки от целей обнаружения ДВПП [82].
12.3.6. Применение инструментальных методов в пищевой промышленности
Некоторые методы, некогда предложенные для определения численности или для идентификации и типирования микроорганизмов [63, 97], почти не использовались в производственных условиях, и существующие в настоящее время инструментальные средства – это результат усовершенствований, нацеленных на их адаптацию к промышленным нуждам. Например, турбидиметрические измерения, использующие планшет-ридеры (сканирующие спектрофотометры для чтения пластин), о которых сообщалось как о пригодных для промышленного использования [205], применяются практически лишь в исследовательских лабораториях, где они зарекомендовали себя полезным инструментом, позволяющим получать одновременно большое количество параметров роста микроорганизмов. Серийно выпускались приборы, основанные на радиометрии, ИК-спектрометрии и микрокалориметрии [63, 87] – так, радиометры довольно часто использовали в США в промышленных условиях переработки цитрусовых [225]. Для микробиологического контроля пищевых продуктов на присутствие дрожжей, по нашим сведениям, они оказались не очень пригодными и в настоящее время не упоминаются в перечнях необходимого оборудования [82]. На принятие решения о внедрении тех или иных методов инструментального контроля также оказывает влияние исчезновение серийно выпускавшихся приборов (например, выпуск колориметра Omnispec Bioactivity Monitor System[82] для обнаружения патогенных микроорганизмов был прекращен без всякой замены) и степень надежности технической поддержки.
В США около 70% из всего числа микробиологических тестов осуществляется с использованием ручных или традиционных методов, и лишь в 30% случаев применяют «ускоренные методы» [82]. В 2005 г. эти цифры выравниваются и в настоящее время применение традиционных и ускоренных методов составляют 50% для каждой из этих групп методов, причем при анализе на патогенные микроорганизмы ускоренные методы будут составлять 60-70% всех тестов. Аналогичных данных об анализах на присутствие дрожжей нет, но доля ускоренных методов здесь, конечно, ниже – по крайней мере, по рыночным соображениям применение инструментальных методов в промышленности для контроля численности дрожжей будет зависеть от разработки оборудования для медицины. Именно так обстоит дело с ускоренным определением общей численности жизнеспособных микроорганизмов в мясе методом FTIR (Fourier Transform Infrared Spectroscopy, инфракрасная спектроскопия на основе преобразования Фурье) с последующим компьютерным интегрированием спектров. Отмечается, что уровень 107 бактерий в 1 г (пороговый биохимический показатель начала порчи) – соответствует началу протеолиза [66]. Высокая скорость этого бесконтактного метода (имеются данные о времени отклика 60 с) обусловливает его ценность для систем НАССР.
Результаты наших запросов, направленных производителям приборов и оборудования, сведены в табл. 12.3. Высокая стоимость этого дорогого оборудования и потребность в квалифицированных кадрах в настоящее время ограничивают его применение высокодоходными непищевыми отраслями промышленности (производство косметики и лекарств), а в пищевой промышленности – предприятиями, выпускающими пищевые продукты, особо подверженные действию патогенных микроорганизмов, и крупными заводами молочной и пивоваренной промышленности. Увеличение потребления готовых к употреблению пищевых продуктов со сроком годности менее одного месяца должно стимулировать применение ускоренных методов анализа. Недавние вспышки заболеваний, вызванных потреблением фруктов и овощей, потребуют в ближайшее время применения ускоренных методов инструментального контроля и в производстве плодоовощной продукции [82]. Универсальность приборов, позволяющих обнаруживать как патогенные микроорганизмы, так и ДВПП, – основной фактор, определяющий применимость инструментальных методов контроля количества дрожжей. Применимость многих инструментальных методов анализа зависит от предварительного культивирования и имеет ограничения, связанные с нехваткой культуральных сред, специфичных для ДВПП. Тем не менее можно ожидать, что приборы для биолюминесцентного анализа благодаря их простоте и снижающейся стоимости портативной аппаратуры вскоре станут привычным оборудованием санитарно-гигиенической лаборатории. Это положительно скажется на эффективности производства благодаря стимулированию персонала к качественному проведению мойки и дезинфекции оборудования и психологическому эффекту [156].
