Наряду с обнаружением и подсчетом дрожжевых клеток микробиологический контроль может быть также направлен на их идентификацию, выявление характеристик или типирование. Классическая идентификация дрожжей основана на их физиологических, биохимических или половых характеристиках, однако последние достижения в таксономии дрожжей достигнуты благодаря молекулярным методам [117].Выявление характеристик или типирование дрожжей связаны с применением методов анализа химического и молекулярного состава дрожжевых клеток и иногда позволяет получить информацию на уровне подвидов.

12.4.1. Классические методы и их упрощенное применение в пищевой промышленности

Классические методы идентификации не могут широко применяться в пищевой промышленности из-за их длительности и трудоемкости, и поэтому были разработаны упрощенные версии этих методов. Они основываются на тех же принципах, и по-прежнему занимают довольно много времени даже в условиях автоматизации и компьютеризации отдельных процедур. Кроме того, зачастую они дают ошибочные или сомнительные результаты идентификации [53, 77, 83]. В настоящее время по-прежнему используются физиологические и биохимические методы, однако они требуют квалифицированной интерпретации данных соответствующими специалистами [182]. Практическая идентификация дрожжей намного облетается при использовании дихотомических ключей. Упрощенный ключ для идентификации наиболее опасных для пищевых продуктов видов дрожжей представлен в работе [167]. Обновленный «упрощенный метод идентификации» (Simplified Identification Method, SIM) [53] содержит дихотомический ключ, который в настоящее время применяется к изолятам промышленных фруктовых соков [192]. Известна также фенотипическая система идентификации присутствующих в пищевых продуктах дрожжей [223], а в работе [142] представлен дихотомический ключ для идентификации дрожжей, восстанавливаемых из кислых сброженных пищевых продуктов и кормов для скота. Миниатюризованные системы идентификации, подобные Vitek, АРТ 32С, API 20СAUX, MicroScan, Yeast Star, Auxacolor иRapID Yeast Plus [53, 83, 118, 182, 189] предназначены в основном для анализа клинических образцов и практически не применяются в пищевой промышленности. Например, системы RapID Yeast Plus и API 20CAUX при тестировании апельсинов дают правильные результаты лишь для 35 и 13%случаев соответственно [10]. Дальнейшее совершенствование промышленных систем идентификации видов дрожжей, присутствующих в пищевых продуктах, зависит от потребностей производственных лабораторий, а в настоящее время для получения более высокого процента правильных анализов можно комбинировать выходные данные этих минисистем с компьютерной обработкой, применяемой в классических методиках [77], или с базой данных SIM [50]. Традиционные методы идентификации дрожжей могут также включать хемотаксономические определения, в частности, наличия убихинона (кофермента Q) и моносахаридного состава клеточных стенок [116], которые иногда позволяют классифицировать штаммы, генотипические и фенотипические данные которых дают противоречивые результаты [172].

Таблица 12.3. Серийно производимые приборы и оборудование для обнаружения и определения численности дрожжей в пищевых продуктах (по данным производителей оборудования)

12.4.2. Химические методы

Для преодоления недостатков классических методик разработаны альтернативные экспресс-методы типирования, основанные в том числе на анализе общего содержания белка [218, 219], изоферментов [62] и высокомолекулярных жирных кислот [11, 57, 135, 149, 190, 192]. Эти методы не предназначены для полной замены классических методов идентификации дрожжей, а позволяют получить дополнительные характеристические признаки. Химические методы долгое время считались спорными вследствие их зависимости от физиологического состояния дрожжевых клеток [177, 213], но этот фактор важен лишь для экстремальных условий среды, а такие условия не используются для выделения ДВПП [127]. Одна из таких систем (MIDI, г. Ньюарк, США), основанная на анализе жирнокислотного состава, выпускается серийно и широко применяется для идентификации бактерий [28], а также клинических дрожжей, выращиваемых на агаровых средах, и диких дрожжей, выделяемых из окружающей среды (см. сайт). На составе дрожжевых высокомолекулярных жирных кислот также основывается принцип действия зимологических индикаторов, которые в отличие от молекулярных биологических методов имеют большое значение для промышленности (см. далее раздел 12.5.1).

Разработаны и другие перспективные методы, использующие сложный инструментарий, – например, «фингериринтинг» (метод анализа «отпечатков пальцев» микроорганизмов) – но их применение ограничивается пока исследовательскими центрами с хорошо обученными лаборантами. К перспективным можно отнести и такие методы, как Circular Intensity Differential Scattering, CIDS, а также пиролитическую масс-спектрометрию (подробнее о них см. [97]). Первый используется в проточной цитометрии, а второй позволил создать значительно более простой и быстрый спектрометрический метод MALDI-TOF-MS (Matrix Assisted Laser Desorption Time Of Flight Mass Spectrometry), применяющийся для непосредственного профилирования белков из клеток млекопитающих [35], для ускоренной дифференциации неповрежденных клеток бактерий [36, 73] и для непосредственного поверхностного анализа видов грибов [212]. Случаи его применения для анализа ДВПП нам неизвестны.

12.4.3. Типирование на основе нуклеиновых кислот

Методы молекулярной идентификации основываются главным образом на секвенировании 600-650 нуклеотидов области D1/D2крупной субъединицы (26S) рибосомной ДНК (рДНК) вследствие ее таксономической значимости, однако секвенирование не годится для промышленного применения даже несмотря на наличие баз данных генных последовательностей (см. [117]). В последнее десятилетие методы молекулярной биологии все еще считали перспективными для идентификации видов ДВПП при небольшом числе известных приложений [77]. Исследования последних лет оказали влияние на развитие мощных методов типирования, основные из которых представлены в табл. 12.4. Описания методов и обзор баз данных применительно к дрожжам, присутствующим в пищевых продуктах см., например, в работах [130, 177, 213]. Многие методы, представленные в табл. 12.4, применялись для типирования лишь немногих видов и родов дрожжей, и несмотря на их эффективность, серийных исследований на большем количестве видов проведено не было.

Таблица 12.4. Достижения молекулярной биологии в области разработки методов типирования дрожжей, присутствующих в пищевых продуктах

Некоторые сокращения: DNA - ДНК; RNA – РНК; rDNA – рДНК, mtDNA – мтДНК.

Основой большинства ускоренных методов типирования в настоящее время является полимеразная цепная реакция (ПЦР, Polymerase Chain Reaction, PCR) [213] и, в частности, анализ КАLP-PCR (Restriction Fragment Length Polymorphism by PCR, полиморфизм неразборчиво фрагментов рестрикции с помощью ПЦP) области 5.8S-ITS рДHК (Internal Transcribed Spacer, внутренний транскрибированный спейсер) является первым молекулярным методом, пригодным для идентификации видов дрожжей в промышленных условиях [177]. База профильных данных 5.8S-ITS включает 300 видов дрожжей и доступна на сайте http://motor.edinfo.es/iata [177]. Этот метод считают наилучшим для быстрой и точной идентификации дрожжей,
выделяемых из фруктов и продуктов их переработки [10]. Кроме того, при необходимости подтверждения результатов рекомендуется использовать таксономически значимую последовательность гена 26S рДНК и классические методики. До тех пор пока указанная база профильных данных рестрикционного анализа полностью не укомплектована, можно использовать анализ последовательностей (секвенирование) области ITS  [102].

Что касается типирования штаммов на внутривидовом уровне, широко используется рестрикционный анализ митохондриальной ДНК (мтДНК) с применением различных рестрикционных ферментов (рестриктаз) для выявления свойств преимущественно штаммов S. cerevisiae (табл. 12.4). Количество и разнообразие рестриктаз зависят от исследуемых штаммов и зачастую становятся ясным только после неудачной идентификации этих штаммов с помощью ферментов, испытываемых в первую очередь. Это также касается и рестрикционных ферментов, используемых в профилировании 5.8S-ITS и выбора праймеров в методах, основанных на RAPD (Random Amplified Polymorphic Determination), что затрудняет их применение в обычных производственных лабораториях. ПЦР-фингерпринтинг, использующий простые многоразовые праймеры (GTG)5, предоставляет информацию на подвидовом уровне, что позволяет его применять вместе с анализом RFLP-PCR областей 18S рДНК и ITSдля отслеживания путей контаминации на технологических линиях. В целях промышленного тестирования создана база данных образцов ПЦР-«отпечатков пальцев» по 650 видам дрожжей [213]. Еще одним основанным на ПЦР методом, применяемым к дрожжам, присутствующим в пищевых продуктах, является AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism). Его преимуществом над RAPD и ПЦР-фингерпринтингом является хорошая воспроизводимость результатов [213]. Во многих электрофоретических методах интерпретация большого разнообразия гель-дорожек требует применения специального программного обеспечения [213] с дополнительными финансовыми затратами и потребностью в квалифицированном персонале.

Ускоренную возможность типирования на различных таксономических уровнях дают олигонуклеотидные зонды на основе уникальных последовательностей, а развитие технологий молекулярных массивов позволяет оперировать с большим количеством зондов [117]. Применение молекулярных зондов на основе пептидонуклеиновых кислот (ПНК, PNA) для ускоренной идентификации видов дрожжей благодаря своей простоте является весьма перспективным (см. [202]), особенно для промышленного тестирования. От момента выделения штамма до получения результатов проходит около 2 ч, причем гибридизация осуществляется в микроскопических препаратах. Затем с помощью микроскопии проверяют положительные результаты, которые легче интерпретировать, чем профильные характеристики гель-спектров в вышеупомянутых методах RFLP, RAPD или AFLP. Наш опыт флуоресцентного анализа с использованием ПНК-зонда, специфичного к D. bruxellensis, свидетельствует о возможности его широкого применения [57], чего нельзя сказать о другом ПНК-зонде (для Z. bailii) [161], оказавшемся не полностью специфичным и требующим дальнейшего совершенствования. Основной недостаток этих методов заключается в необходимости использования дорогого флуоресцентного микроскопа. Несмотря на огромные потенциальные возможности, ПНК-пробы для ДВПП пока еще недоступны для массового применения. Указанные в табл. 12.4 иные новые методы для применения in situ - например, DGGE (Direct Gel Gradient Electrophoresis, прямой градиентный гель-электрофорез), COX1-интроны, моментальная ПЦР – также являются многообещающими, поскольку у них нет необходимости в стадии культивирования. Эти методы значительно более быстрые, чем методы, зависящие от времени культивации, поскольку не требуют выращивания дрожжей и очистки штаммов, но они не дают информации о жизнеспособности клеток и, в случае низкой чувствительности, позволяют идентифицировать только доминирующие штаммы. При использовании методов низкой чувствительности in situ могут быть пропущены немногочисленные популяции, как зачастую случается с опасными ДВПП. Кроме того, оборудование, необходимое для выполнения таких анализов, для промышленного использования весьма недешево (например, аппаратура для метода моментальной ПЦР стоит около 40 000 евро) и ее применение требует специальных знаний.

Молекулярные методы до сих пор не дошли до лабораторных столов микробиологов-пищевиков. Вполне вероятно, что препятствием для их повсеместного внедрения является непрерывное их совершенствование, поскольку отсутствует база для критической оценки соответствующих методик. Те методы, которые способны противостоять непрерывным изменениям и оставаться неизменно падежными, безусловно, зарекомендуют себя в промышленных лабораториях. Разрыв между наукой и производством будет сокращаться, если новые методы докажут свою эффективность и рентабельность на практическом уровне. Только тогда они будут успешно внедряться на производстве и станут эффективными рабочими инструментами для идентификации ДВПП. В настоящее время молекулярные методы больше подходят дляисследовательских лабораторий, организаций, занимающихся сертифицированием, и других вспомогательных лабораторий, обеспечивающих проведение эпидемиологических исследований, которые иногда консультируют промышленные предприятии по их запросам.