13.2.1. Свободные жирные кислоты
Свободные жирные кислоты (СЖК) образуются в пищевых продуктах в основном в результате гидролитической, а не окислительной порчи. Тем не менее измерение их количества зачастую выполняется параллельно с определением продуктов окисления липидов, что особенно важно для фритюрных жиров. Кроме того, СЖК используют в качестве индикатора окислительной стабильности при хранении жареных пищевых продуктов (например, картофельных чипсов) [8]. СЖК участвуют в формировании посторонних привкусов (особенно в молочных продуктах) и так или иначе связаны с ними – например, именно они обусловливают резкий запах пальмового масла [9], СЖК образуются в процессе липолиза (см. главу 8) в исходных ингредиентах пищевых продуктов, и затем выступают в роли субстратов для ферментов (например, липоксигеназ), катализирующих окислительную порчу.
Несмотря на многочисленность методов, применяющихся для определения содержания СЖК, самым распространенным методом остается титриметрический метод определения кислотного числа с помощью гидроксида калия или натрия. Навеску экстрагированного масла или жира массой 1 г помещают в растворитель (обычно это спирто-эфирная смесь или этанол) и затем проводят титрование 0,1 M раствором щелочи, используя в качестве индикатора фенолфталеин или Alkali Blue 6В. Для сильно окрашенных масел, в которых затруднена визуализация точки эквивалентности, используют потенциометрическое титрование или титрование проводят до конечного значения рН, равного 10,8. Результаты выражают в процентах содержания СЖК в образце или в виде «кислотного числа». Последнее представляет собой массу гидроксида калия (мг), необходимую для нейтрализации кислот, содержащихся в 1 г масла или жира.
13.2.2. Перекисное число
Поскольку гидропероксиды образуются на ранних стадиях окисления липидов, определение перекисного числа (ПЧ) применяют для раннего обнаружения прогорклости, например, свиного жира (лярда) [10]. ПЧ легко определить путем титрования выделенного йода, образующегося в результате реакции гидроперекисей с йодидом калия. Для этого навеску жира или масла сначала растворяют в смеси уксусной кислоты с хлороформом или изооктаном в пропорции 60:40. Йодид калия вносят в виде насыщенного раствора. Затем после выдержки образцов в темноте без доступа кислорода добавляют воду для прекращения реакции. На протяжении всего анализа проводится перемешивание путем вспенивания реакционной смеси азотом или диоксидом углерода, что способствует удалению растворенного кислорода. Выделившийся йод затем титруют с помощью 0,002 М тиосульфата натрия с использованием в качестве индикатора крахмала или потенциометрически с применением автотитратора. ПЧ выражают в милли-эквивалентах (иногда в миллимолях) активного кислорода на 1 кг жира.
Так как гидроперекиси весьма нестойки и легко разлагаются при повышенных температурах, экстрагирование масла или жира следует производить только на холоде. Значительного внимания требует также стадия отгонки растворителя. Чтобы исключить испарение, экстрагирование жира из сухих пищевых продуктов производят хлороформом или изооктаном, а в случае влажных продуктов смесью хлороформа с метанолом. После этого отдельные аликвотные пробы полученного экстракта используют для измерения ПЧ, а в других определяют массу жира.
Поскольку определение ПЧ является относительно несложным тестом, его часто применяют при исследовании срока хранения или при изучении антиокислительных свойств различных добавок. Например, метод определения ПЧ используют совместно с определением СЖК и органолептическим анализом при исследовании жарочных масел и типов упаковки, применяемых в производстве картофельных чипсов; установлено, что использование подсолнечного масла и упаковки из алюминиевой фольги обеспечивает трехмесячный срок хранения [11]. При исследовании вареного измельченного мяса сельди было показано, что снижению ПЧ, тиобарбитурового числа и низкомолекулярных альдегидов способствуют хитозаны [12]. Так как гидроперекиси весьма нестойки и способны разлагаться в течение всего периода хранения продукта, для получения полного представления о глубине окисления после прекращения цепных реакций нельзя полагаться только на ПЧ. При хранении смесей пищевых масел наблюдается увеличение значений перекисных чисел до некоторого максимума и затем постепенное их снижение [13].
13.2.3. Анизидиновое число
Анизидиновое число (АЧ) свидетельствует о содержании в масле или жире альдегидов, в частности ненасыщенных (главным образом 2-алкеналей). Для определения АЧ используют реакцию растворенного в изооктане масла или жира с р-анизидином в ледяной уксусной кислоте, в результате чего образуются продукты, имеющие слабо-желтую окраску. Затем АЧ определяют по показателю оптической плотности, измеряемому при длине волны 350 нм до и после реакции с р-анизидином. По принятому соглашению АЧ определяется как 100-кратное увеличение оптической плотности (λ = 350 нм, I = 1 см) раствора, полученного в результате реакции анизидинового реактива с 1 г масла или жира в 100 мл растворителя. Этот метод не пригоден для сильно окрашенных масел с высоким светопоглощением при этой длине волны.
В качестве показателя содержания вторичных продуктов окисления AЧ используют вместо (или совместно с) ПЧ при оценке степени окисленности масел, подвергшихся тепловому воздействию. Например, АЧ применяют в исследованиях максимизации срока хранения жарочных масел [14]. AЧ определяют также параллельное органолептическим анализом, например, при исследовании хранения чипсов, обжаренных в различных маслах [15]. При изучении ускоренных тестов хранения промышленных образцов жира было установлено, что AЧ является удобным тестовым показателем для определения стабильности продукта при хранении [16].
13.2.4. Totox-показатель
Для определения totox-показателя (TП) иногда одновременно с анизидиновым числом измеряют ПЧ (TП = 2ПЧ + AЧ). Этот показатель учитывает как «окислительную предысторию» масла, так и его устойчивость к дальнейшей порче. Как правило, если ТП меньше 10, то можно ожидать, что качество масла будет приемлемым.
В течение начальной фазы окисления липидов содержание гидроперекисей может возрастать до некоторого максимума, а затем снижаться. Одновременно с распадом гидроперекисей начинают образовываться карбонильные соединения. В ходе ускоренного тестирования сроков хранения масла из виноградных семечек было установлено, что в течение хранения ТП возрастает линейно [17]. При оценке качества замороженной говядины ТП был признан наилучшим индикатором окисления липидов – другие тесты оказались менее надежными [18].
13.2.5 2-ТБК тест
Раньше считалось, что тест с использованием 2-тиобарбитуровой кислоты (2-ТБК) оценивает преимущественно содержание малонового диальдегида (МДА). В настоящее время известно, что 2-ТБК вступает в реакции с целым рядом соединении, поэтому современное название этого показателя – «вещества, реагирующие с 2-ТБК» (TBARS, Thiobarbituric Acid Reactive Substances). Красный пигмент, которым поглощает при длине волны 532 нм, образуется в результате реакции 2-тиобарбитуровой кислоты с 2-алкеналями и 2,4-алкадиеналями, а также с МДА. Измерение светопоглощения желтого пигмента при 450 нм (ТВARS 450) использовалось рядом исследователей при изучении сроков хранения сублимированного мяса [19].
2-ТБК тест обычно используется в качестве индикатора окисления липидов, особенно мясных и рыбных продуктов. Для выполнения 2-ТБК теста чаще всего применяют прямое экстрагирование или отгонку. Вариант прямой экстракции, применяемый в случае сырого мяса и рыбы, включает вымачивание образцов в 7,5%-ном растворе трихлоруксусной кислоты. После фильтрования экстракта аликвотная проба реагирует с 2-ТБК при нагревании в кипящей водяной бане в течение 35 мин. После охлаждения растворы фотометрируют относительно контрольного образца и сравнивают с образцами, приготовленными на основе 1,1,3,3-тетраэтоксипропана. Для количественной оценки 2-ТБК теста используют градуировочный график оптической плотности относительно содержания МДА (в мкг). Содержание МДА выражают в мг МДА/кг продукта.
Отварное мясо или образцы с высоким содержанием жира, неоднородность которых может создавать проблемы при спектрофотометрировании, обычно анализируют после предварительной дистилляции в роторном испарителе. После экстрагирования в трихлоруксусной кислоте и последующего центрифугирования аликвотную пробу подвергают отгонке с контролируемой скоростью до тех пор, пока не будет собран требуемый объем дистиллята. После этого для реакции с 2-ТБК отбирают пробу дистиллята. Этот способ не обеспечивает полного извлечения МДА, поэтому необходимо подвергать дистилляции и стандартные образцы. Этот прием используют для образцов масел и жиров, а также для экстрактов липидов из образцов мяса и рыбы. Обзор методик 2-ТБК тестирования приведен в работе [20]. К другим вариантам данного метода относят использование микроплат для одновременного анализа большого числа образцов и применение непрерывного проточного анализа для исследования пивоваренного сырья [21, 22].
2-ТБК тест является хорошим индикатором прогорклости (особенно для мясных и рыбных продуктов), однако следует помнить, что вступать и реакции с 2-ТБК могут и другие вещества, присутствующие в пищевых продуктах, – сахара, кислоты, сложные эфиры, аминокислоты и окисленные формы белков [23]. Так как на фактическое содержание 2-ТБК в образцах пищевых продуктов влияет их жирнокислотный состав, при сравнении результатов, полученных для различных типов продуктов, следует проявлять осторожность.
13.2.6. Тест Крейса
Одним из старейших тестов, разработанных для контроля окисленности липидов и пригодных для промышленного применения, является тест Крейса (Kreis), который использовали в качестве раннего индикатора прогорклости. Этот тест включает колориметрический анализ интенсивности красного цвета, формирующегося в результате реакции флороглюцина с эпигидриновым альдегидом и другими продуктами окисления липидов. Красный цвет измеряют по атласу цветов с помощью колориметра Lovibond модели F или PFX995 (фирмы The Tintometer Ltd, г. Солсбери, Великобритания) и выражают в единицах красного по шкале Lovibond. Результаты всестороннего изучения теста Крейса, включая его кинетику, оптимальные экспериментальные условия и корреляцию результатов с органолептическими данными приведены в работах [9, 24, 25]
