13.4.1. Анализ содержания полярных соединений с помощью жидкостной хроматографии

Во время жарки во фритюре качество жарочных масел вследствие комбинированного воздействия гидролиза, окисления липидов и полимеризации ухудшается. Эти процессы ведут к образованию продуктов распада липидов – СЖК, моно- и диглицеридов, а также окисленных или полимеризированных триглицеридов, измеряемых как общее содержание полярных соединений (ОСПС). Жарочные масла считаются непригодными для потребления, если ОСПС превышает 25-30%, и во многих странах приняты нормативы по ОСПС. Хотя индикатором ОСПС является измерение ДП, официальным методом по ISO 8420 является определение ОСПС методом жидкостной хроматографии на силикагеле.

Для осуществления хроматографического разделения стеклянную колонку заполняют силикагелем с размером ячейки сита от 70 до 230 при 5%-ном содержании воды. После внесения 1 г образца масла в верхнюю часть колонки производят элюирование неполярной фракции, состоящей в основном из неокисленных триглицеридов, смесью петролейного и диэтилового эфиров (в соотношении 87:13). После выпаривания растворителя неполярное содержимое определяется гравиметрически и затем по разнице вычисляется ОСПС. Для элюирования ОСПС может использоваться 100%-ный диэтиловый эфир, но в этом случае извлечение для точной количественной оценки будет недостаточно полным. Для оценки эффективности колонки применяют тонкослойную хроматографию, позволяющую проводить анализ неполярной и полярной фракций.

Поскольку хроматографический анализ занимает слишком много времени, для определения ОСПС применяют и другие методы, в том числе дифференциальную сканирующую калориметрию и различные «экспресс-тесты», основанные на спектрофотомерии, измерении ДП или вязкости [30]. В последнем случае используют устройство Fri-check фирмы MirOil (г. Аллентаун, штат Пенсильвания, США), а на спектроскопии основан экспресс-тест VERT-FRY PRO фирмы Libra Technologies, Inc. (г. Метючен, штат Нью-Джерси, США). Об эффективности этих тестов см. [31,32].

13.4.2. Определение классов липидов методом ВЭЖХ

СЖК, моно- и диглицериды как продукты гидролитического распада триглицеридов можно анализировать с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием обычной фазовой хроматографии и простого тройного градиента (тройной смеси растворителей с различной элюотропной способностью). Авторы настоящей главы использовали колонку Lichrosorb SI60 (10 х 4,6 мм, 5 мкм) и смесь толуола, этилацетата и муравьиной кислоты (табл. 13.1). Для идентификации липидных классов использовался испарительный светорассеивающий детектор PL-EMD 950 фирмы Polymer Laboratories (г. Черч Среттон, графство Шропшир, Великобритания), при этом количественное определение проводилось относительно внешних стандартов с применением метода многоуровневой калибровки.

Таблица 13.1 Градиент концентраций смеси растворителей для осуществления разделения «нейтральных» липидных классов методом ВЭЖХ

Растворитель А: толуол – этилацетат – муравьиная кислота, 400 : 5 : 4; растворитель В: этилацетат – муравьиная кислота, 99,5 : 0,5. Скорость потока: 1,5 мл/мин.

Если пищевой продукт представляет собой сырое мясо, рыбу или овощи, то при его хранении возникают проблемы, связанные с активностью ферментов (в частности, липазы и липоксигеназы). Действие липаз или фосфолипаз приводит к образованию СЖК, являющихся благоприятным субстратом для липоксигеназ. Поэтому при исследовании окисления липидов важно отслеживать липолиз как триглицеридов, так и фосфолипидов и галактолипидов (мембранных липидов) (см. главу 8). Поскольку хроматографическое разделение нейтральных и полярных липидных классов достигается с большим трудом, то для его осуществления оказывается необходимым использовать четвертичного градиента растворителей. При проведении ВЭЖХ-анализа для «прогона» многошагового нелинейного градиента (табл. 13.2) мы использовали насос Perkin Elmer серии 410, колонку Lichrosorb SI60 (100 х 4,6 мм, 5 мкм) и детектор PL-EMD 950. Этот метод, являющийся модификацией опубликованного в [33] метода, позволил получить хорошо воспроизводимое разделение нейтральных липидов, фосфолипидов игалактолипидов (рис. 13.1).

Таблица 13.2 Градиент концентраций смеси растворителей для осуществления разделения нейтральных и полярных липидных классов методом ВЭЖХ

Растворитель А: толуол – этилацетат – муравьиная кислота, 400 : 6 : 4; растворитель В: метанол – хлороформ – муравьиная кислота, 600 : 100 : 35; растворитель С: вода – муравьиная кислота, 99,5 : 0,5; растворитель D: этилацетат – муравьиная кислота, 99,5 : 0,5. Скорость потока: 1 мл/мин.

13.4.3. Анализ гидроперекисей с помощью ВЭЖХ

Высокоэффективная жидкостная хроматография некоторых гидроперекисей применяется как при исследовании развития окислительной порчи, так и при изучении активности липоксигеназ в сыром мясе, рыбе и овощах. ВЭЖХ с ультрафиолетовой детекцией при длине волны 234 нм используют для анализа продуктов окисления линолевой кислоты, образование которых катализировали липоксигеназы семян гороха, а сочетание жидкой хроматографии с масс-спектрометрией - для их идентификации [34]. При этом показана возможность осуществления анализа гидроперекисей, гидроокисей и кетоновых жирных кислот за одни хроматографический цикл. Для проведения ВЭЖХ-анализа гидроперекиси восстанавливают до более стабильных гидроксипроизводных, используя реакцию с боргидридом натрия. Кроме того, возможно также анализировать их и без этого преобразования, если для выявления свойств гидроперекисей, образующихся при окислении линолевой и линоленовой кислот, использовать масс-спектрометрию [35].

Имеются данные о разработке двух методик на базе люминесцентных методов детектирования с использованием цитохрома С и люминола [36]. Эти методики применялись при изучении образования гидроперекисей в сливочном масле и молочных спредах в процессе хранения; была отмечена их экспрессность и чувствительность, а также высокая корреляция результатов с анализами по показателю ПЧ.

13.4.4. Оценка содержания летучих веществ с помощью газовой хроматографии

На последних стадиях окисления липидов образуются разнообразные классы летучих соединении - спирты, альдегиды, кетоны, алканы и органические кислоты. Многие из них ответственны за формирование посторонних привкусов, и их содержание можно легко оцепить с помощью метода газовой хроматографии. В сочетании с масс-спектрометрией (метод ГХ-МС) он позволяет идентифицировать летучие вещества. Самой сложной проблемой, которая встает перед исследователем, является выбор и оптимизация соответствующего метода подготовки проб. Это может быть одновременная дистилляция и экстракция, статический и динамический ароматографический анализ, твердофазная микроэкстракция и сорбционная экстракция.

13.4.4.1. Одновременная дистилляция и экстракция

Одновременная дистилляция и экстракция (ОДЭ) – относительно простой по не волнению метод подготовки проб, по занимающий довольно много времени. Чаще всего применяют аппарат Liкеns-Nіскеrson, позволяющий производить паровую дистилляцию при одновременном экстрагировании летучих веществ с помощью растворителей. Образец массой 20 г кипятят в течение 90 мин с обратным потоком, а низкокипящий растворитель (например, пентан или диэтиловый эфир) кипятят в другой колбе. Затем в конденсирующем устройстве, куда поступают оба паровых потока, летучие вещества смешиваются с парами растворителя, конденсируются и накапливаются в приемной колбе. После этого используется низкотемпературная отгонка растворителя в потоке азота для концентрирования экстракта до объема, приемлемого для прямого впрыска в газовый хроматограф. Поскольку анализируемые образцы имеют достаточную молекулярную массу, данный метод обладает хорошей чувствительностью и подходит для экстрагирования летучих соединений с высокой молекулярной массой.

Потенциальные проблемы, связанные с ОДЭ, можно минимизировать за счет введения определенных профилактических мер, например, тщательной мойки стеклянной посуды в целях избежания загрязнения ее моющими средствами. Источниками загрязнения могут стать даже духи или лосьон после бритья, которыми пользуется лаборант-химик. Холостую экстракцию следует производить даже при использовании высокочистых растворителей, поскольку любые присутствующие в них примеси могут давать маскирующий эффект. Использование слишком высоких температур при выполнении ОДЭ может приводить к искажению результатов. Исследование летучих ароматических веществ трески показало, что ошибки возникают вследствие окисления липидов, и их можно избежать, используя антиоксиданты или удаляя из продукта кислород [37]. Несмотря на эти недостатки, ОДЭ применяют при исследованиях сроков хранения пищевых продуктов, например, ароматизированного риса [38]. Было показано, что после 3 мес. хранения при 30°С и относительной влажности 84% в нем возрастает общее содержание летучих веществ, что объясняется, в основном, образованием альдегидов и кетонов.

13.4.4.2. Статический ароматографический анализ

Статический ароматографический анализ – очень простой метод отбора проб. Образец нагревают в закрытом бюксе в течение времени, необходимого для выделения летучих соединений в свободное газовое пространство над образцом и для достижения равновесного состояния. Затем производят отбор газообразных проб, обычно 1-5 мл, и впрыскивают в газовый хроматограф для анализа. Этот простой и быстрый метод позволяет получить пробу летучих веществ, репрезентативно представляющую пищевой продукт с точки зрения органолептического восприятия, однако он характеризуется низкой чувствительностью и позволяет обнаруживать только соединения в высокой концентрации. Еще одним его недостатком является ограниченная емкость бюкса, что затрудняет отбор представительной пробы пищевых продуктов.

 13.4.4.3. Динамический ароматографический анализ

Ограничения статического ароматографического анализа можно преодолеть, используя динамический отбор проб, известный также как «продувка и улавливание». Летучие вещества выдуваются из образца потоком инертного газа, направленного на его поверхность образца или пропускаемого через жидкий образец. После этого поток газа, обычно азота или гелия, проходит сквозь уловитель с абсорбентом, например, тенаксом (Тепах) или хромосорбом (Chromosorb). Для переноса летучих веществ из уловителя в газовый хроматограф обычно используется термодесорбция, хотя можно проводить и элюирование растворителем с последующим прямым впрыском в газовый хроматограф [39].

В настоящее время серийно производятся устройства, автоматизирующие весь процесс, - например, Tekmar LSC 2000 (недавно замененный новым аппаратом Velocity ХРТ производства фирмы Teledyne Tekmar, г. Лос-Анджелес, США). Образец помещают на дно U-образной трубы, присоединенной к устройству и оснащенной нагревательной рубашкой, регулируемой с помощью термореле. Поток гелия обдувает образец и переносит летучие вещества в уловитель с тенаксом. Такая «сухая продувка», при которой гелий проходит только через уловитель, помогает удалять избыточную влагу. Затем для переноса летучих веществ верхнюю часть колонки газового хроматографа производят термодесорбцию. После этого летучие вещества криофокусируются жидким азотом, верхнюю часть колонки быстро нагревают, и начинается хроматографический цикл. Основной недостаток систем этого типа заключается в том, что перед работой со следующим образцом весь предшествующий процесс, включая хроматографический цикл, должен полностью завершиться. Это существенно ограничивает количество образцов, которое можно проанализировать за один день.

Альтернативой является проведение продувки и улавливания отдельно от термодесорбции и газохроматографического анализа. Это позволяет осуществить система автоматизированной термодесорбции, например, ATD 400 фирмы PerkinElmer (г. Биконсфилд, Великобритания). Уловитель летучих веществ в этой системе включает десорбционную трубку из нержавеющей стали, заполненную соответствующим адсорбентом. Для продува образца эта трубка может подсоединяться напрямую или с помощью короткого тюбинга с продувочным резервуаром (по выбору пользователя). Это облегчает выбор формы и размера продувочного резервуара и, следовательно, типа пищевого продукта и количества образцов. В устройстве ATD 400 десорбционные трубки размещены в виде карусели, и поэтому содержимое каждой из них анализируется по очереди. Летучие вещества термически десорбируются из трубы в потоке гелия и переносятся через входную щель в холодный уловитель, после чего последний нагревается для переноса летучих веществ через выходную щель на колонку газового хроматографа. Наличие входной и выходной щелей позволяет оптимизировать расход гелия для каждой стадии процесса, обеспечивая эффективный перепое летучих веществ и удаление избыточной влаги.

Такая система обеспечивает большую степень вариативности процесса продувки и улавливания и характеризуется повышенной пропускной способностью образцов. К ее недостаткам можно отнести, во-первых, возможный «проскок» некоторых летучих соединений в случае чрезмерной продолжительности, высокой температуры или скорости процесса продувки и улавливания. Тем не менее несмотря на возможные потери каких-то летучих соединений вследствие такого «проскока», улавливаемое количество обычно пропорционально фактическому содержанию этих соединений в образце. Во-вторых, высокий процент летучих веществ, которые были сосредоточены в десорбционной трубке, теряется из-за использования щелей. Таким образом, какой бы тип системы не использовался, метод продувки с улавливанием обеспечивает значительное повышение чувствительности по сравнению со статическим ароматографическим анализом и тем самым позволяет обнаруживать гораздо больший спектр соединений.

13.4.4.4. Твердофазная микроэкстракция

Еще один метод, который относительно легко выполняется и может использоваться для всех газовых хроматографов, – это твердофазная микроэкстракция (Solid Phase Microextraction, SPME). В аппарате используется короткое волокно из кварцевого стекла с абсорбирующим покрытием, которое помещено в защитную полую иглу, смонтированную на шприцеподобном устройстве. Волокно покрыто тонким слоем абсорбента или адсорбента (например, дивинилбензолом или полидиметилсилоксаном, PDMS). Для отбора проб летучих веществ волокно выдвигается из иглы и подвергается воздействию летучих веществ, присутствующих над образцом в закрытом бюксе. Как и при обычном статическом хроматографическом анализе газовой среды над продуктом, прежде чем волокно втягивается обратно в иглу, образец определенное время выдерживают для достижения равновесного состояния. Для проведения ГХ-анализа волокно извлекают из иглы в инжекторном отверстии. После термодесорбции летучие вещества попадают на колонку газового хроматографа. Этот процесс легко можно автоматизировать для работы с газожидкостным хроматографом.

Для более эффективной экстракции летучих веществ на покрытие волокна необходимо учитывать ряд параметров – температуру, длительность анализа, объем (пли концентрацию) пробы, объем свободного газового пространства над продуктом и тип используемого сорбента. При любых заданных условиях количество конкретного абсорбированного соединения определяется Коэффициентом распределения между образцом и свободным газовым пространством, с одной стороны, и между свободным газовым пространством и покрытием волокна, с другой. Для достижения максимальной чувствительности следует подобрать подходящий тип и толщину покрытия волокна исходя из полярности и степени летучести соединения.

Один из основных недостатков данного метода заключается в том, что для получения удовлетворительных результатов необходимы предварительные испытания для оптимизации условий его применения. В частности, это относится к определению ряда летучих соединении, для которых волоконное покрытие волокна характеризуется разной селективностью. Основными преимуществами метода SPME являются его простота, относительная экспрессность и экономичность, а также более высокая чувствительность но сравнению с обычным статическим ароматографическим анализом. В качестве примеров применения этого метода можно привести определение содержания гексаналя и пентаналя в отварной индейке, оценку порогов восприятия запаха ацетальдегида в молоке и воде, а также анализ свободных жирных кислот в сыворотке и продуктов из нее [40-42]. При исследовании продуктов окисления липидов в молоке было установлено, что в отношении пентаналя и гексаналя метод SPME обладает такой же чувствительностью, как метод «продувки и улавливания» [43].

13.4.4.5. Сорбционная экстракция с перемешивающим стержнем

Сорбционная экстракция с перемешивающим стержнем (Stir Bar Sorptive Extraction, SBSE) – разработаный совсем недавно метод, который может рассматриваться как вариант твердофазной микроэкстракции. Как следует из его названия, основа его принципа действия заключается в использовании перемешивающего стержня, покрытого сорбентом PDMS. Отбор летучих веществ производится путем помещения стержня или непосредственно в жидкий образец, или в свободное газовое пространство над твердым образцом. После перемешивания образца в течение 30-60 мин стержень помещают в стеклянную трубку и устанавливают в камеру термодесорбции, соединенную с газовым хроматографом.

Теоретические основы и принципы этого метода изложены в работе [44], где утверждается, что по сравнению с SPME он обеспечивает 500-кратное увеличение чувствительности. К сожалению, в настоящее время публикации относительно применения этого метода для изучений окисления липидов и сроков хранения пищевых продуктов, практически отсутствуют – в литературе описай лишь один пример его использования для определения содержания карбонильных соединении в пиве с затхлым запахом [45].

13.4.5. Идентификация летучих веществ

Для идентификации летучих соединений применяют детекторы нескольких типов. Самым «универсальным» считается пламенный ионизационный детектор (Flame Ionisation Détecter, FID), обладающий хорошей чувствительностью практически ко всем органическим соединениям в очень широком диапазоне. Он относительно дешев, имеет простую конструкцию и удобен в обслуживании. Другие детекторы используют для обнаружения отдельных соединений – например, пламенный фотометрический детектор (Flame Photometric Detector, FPD), настраиваемый на обнаружение соединений, содержащих либо серу, либо фосфор. Азото-фосфорный детектор (Nitrogen Phosphorus Detector, NPD) позволяет идентифицировать как азотсодержащие, так и фосфорсодержащие соединения.

Масс-спектрометр (MC) в паре с газовым хроматографом (ГX) (ГХ-МО) или жидкостным хроматографом (ВЭЖХ) может рассматриваться как своего рода «универсальный» детектор. В настоящее время масс-спектрометры широко используются как относительно недорогие настольные приборы. Применение MC имеет ряд преимуществ по сравнению с пламенными ионизационными детекторами – повышенную чувствительность, возможность идентификации соединений и способность «отсеивания» попутно извлеченных соединений. Использование библиотеки спектров – бесценного инструмента для аналитика – дает возможность быстрой идентификации, хотя изомерные соединения различаются с трудом. Для этого необходимо собрать данные в режиме полного сканирования так, чтобы получить массы всех молекул фрагментов и, соответственно, их спектр. Однако, при наличии некоторого количества образцов-стандартов для известных соединений, данные собирают посредством контроля выбранных ионов (Selected Ion Monitoring, SIM), что обеспечивает повышенную по сравнению с полным сканированием чувствительность. При попутном извлечении двух и более соединений для «распутывания» спектров двух соединений используют программное обеспечение MC с последующей количественной оценкой их с помощью соответствующих характеристических ионных хроматограм. Сочетание «продува и улавливания» с МС-ГХ позволило, например, идентифицировать и количественно определить содержание 40 летучих соединений в образцах молока, хранившихся 4 мес. при 25°С [46].

Еще один тип детектора, который не был упомянут до сих пор, – это человеческий нос, без которого, конечно, не может работать комбинированный метод газовой хроматографии-ольфактометрии. Этот метод может использоваться для получения описания запахов и определения их интенсивности, а также для уточнения, какие летучие вещества отвечают за формирование определенного запаха или постороннего привкуса. Для проведения ГХ-ольфактометрии выходной поток из колонки газового хроматографа разделяется между детектором, например, FID, и нюхательным конусом, в который дополнительно подается увлажненный воздух в целях создания более благоприятных условий для дегустатора. Если запах обнаружен, то дегустатор записывает описание запаха либо напротив пика анализируемого вещества на диаграммном самописце либо «вслепую», так, чтобы избежать влияния пика. Если необходимо определить интенсивность запахов, дегустатор должен дать оценку его силы. Иногда проводят экстракцию аромата и анализ разбавлений (AEDA), для чего проводят серию разбавлений экстракта из образца до тех пор, пока запах не перестанет обнаруживаться.

С появлением таких устройств, как ODO 11 (производства фирмы SGE, Inc., г. Остин, штат Техас, США) стало возможным относительно легко разделять выходной поток из ГХ между нюхательным конусом и MC. Это позволяет идентифицировать, количественно определять и органолептически описывать разнообразные ароматические соединения, присутствующие в пищевом продукте. Основной недостаток ГХ-ольфактометрии – необходимость довольно продолжительного обучения дегустаторов, а также длительность проведения анализа.

13.4.6. Возможности хроматографических методов

В контексте окисления липидов основное назначение газовой хроматографии – анализ летучих соединений. Тем не менее этот метод применяется также для определения жирнокислотного состава продуктов. Например, при изучении потерь полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) вследствие фотоокисления рыбных липидов наблюдалась линейная зависимость между потерями ПНЖК и ПЧ, хотя значительные потери происходили только при очень высоких значениях ПЧ [47]. Газовая хроматография использовалась и для определения профиля СЖК (например, при исследовании сыра «Манчего» в процессе его созревания) [48].

Как уже отмечалось ранее, метод ВЭЖХ используется как для анализа состава липидных классов, так и для выделения некоторых гидроперекисей. Его применяют также как альтернативу спектральному анализу при определении в пищевых продуктах МДА. Например, было показано, что метод противоточной ВЭЖХ с. флуоресцентным обнаружением является довольно чувствительным и воспроизводимым способом определения концентрации МДА в различных пищевых продуктах – сливочном масле, маргарине, растительном масле, мясе и рыбе [49]. При исследовании охлажденного свиного фарша результаты, полученные методом ВЭЖХ с применением в качестве агента для образования пар ионов цетримида (цетавлона), хорошо коррелируют с данными химического анализа [50]. Относительно недавно МС-ВЭЖХ использовались для анализа нелетучих продуктов окисления липидов в растительных маслах с применением МС-ЖХ для разделения и идентификации различных продуктов окисления триглицеридов – эпокси-ТАГ, оксо-ТАГ, гидроперокси-ТАГ и гидрокси-ТАГ [51].