16.2.1. Окислительный стресс
Определяющий фактор здоровья животных, и, следовательно, качества, пищевой ценности и приемлемости мясных продуктов для потребителя – образование свободных радикалов in vivo. [133]. Важнейшими потенциальными стрессовым и факторами в аэробных организмах являются химически активные соединения кислорода (ХАСК). Образование свободных радикалов в живых клетках может быть как случайным, так и закономерным. Большинство продуцируемых в клетках оксидантов обязаны своим появлением четырем эндогенным источникам ХАСК [94]. Небольшие количества ХАСК, включая гидроксильный радикал (НО•), супероксидный (пероксидный) анион (О2•) и перекись водорода (Н2О2), продуцируются в процессе обычного аэробного митохондриального метаболизма. Центральную роль в образовании ХАСК играет, по-видимому, супероксидный анион (О2•-),тогда как другие промежуточные ХАСК образуются в результате цепных реакций, зарождающихся с помощью О2•-. Пероксисомы, к которым относятся ацетил СоА-оксидаза, дофамин-β-гидроксилаза, уратоксидаза и другие ферменты, продуцируют в качестве побочного продукта Н2О2, которая затем расщепляется каталазой. Вместе с тем, часть Н2О2расщепляется и проникает в другие компартаменты, усиливая негативные окислительные изменения. Одной из первичных систем зашиты от естественных токсических веществ, присутствующих в кормах растительного происхождения, является цитохром Р-450 (полифункциональная оксидазная система у животных). Эндогенное введение этих ферментов увеличивает образование свободных радикалов и предотвращает острое токсическое действие инородных химических веществ. С другой стороны, некоторые ХАСК продуцируются целенаправленно. Например, фагоцитарные клетки защищаются от посторонних микроорганизмов, целенаправленно синтезируя в больших количествах О2•-, Н2О2,гипохлорит (-ОСI) и радикал окиси азота (NO•).Хроническое инфицирование вирусами, бактериями, паразитическими червями и печеночной двуусткой приводит к хронической фагоцитарной активности и, как следствие, к хроническим воспалениям и плохому приросту живой массы скота.
Количество эндогенных свободных радикалов может увеличиваться также под действием ряда экзогенных систем. Большое содержание железа и меди в рационе животных или повреждения тканей способствуют образованию окислительных радикалов из пероксидов [68]. Оксиданты могут образоваться в ходе окислительно-восстановительных циклов при потреблении обычной растительной пищи с большим количеством натуральных фенольных соединений. Кроме того, свой вклад в содержание свободных радикалов могут вносить корма, содержащие пищевые отходы, в частности, использованные жарочные масла [131].
К важнейшим ХАСК относятся О2•-,НО• и другие кислородсодержащие радикалы органических соединений (пероксил- и алкоксил-RОО•, RO•), а также химически активные нерадикальные соединения – Н2О2,синглетный кислород (1О2),хлорноватистая кислота (HOCl), гидропероксиды и эпоксидные метаболиты эндогенных липидов. Нерадпкальные группы содержат химически активные кислородсодержащие группы [93]. Кроме того, продуцируются химически активные азотистые соединения (ХААС) – окись азота (NO•),диоксид азота (NO2•)и пероксинитрит (ONOO-)[181].
ХАСК способны окислять липиды, белки, нуклеиновые кислоты и другие макромолекулы, что ведет к гибели клеток и повреждению ткани [161]. Окисление липидов – наиболее широко используемый показатель окислительных процессов в ткани животных при стрессе, хотя оно зачастую сопровождает, а не вызывает повреждение или гибель клеток [70].
16.2.2. Окисление липидов
Фундаментальные принципы окисления липидов изложены в многочисленных работах [11, 42, 50, 82, 214], причем многочисленные факты свидетельствуют, что окисление липидов происходит in vivo[52, 54, 55, 72, 134]. Механизм окисления липидов in vivo, а также в мясных пищевых системах, определяется участием свободных радикалов, причем окисление начинается с фракции высоко ненасыщенных фосфолипидов в субклеточных мембранах. Процесс начинается с отделения из полиненасыщенной жирной кислоты (LH) bis-аллильного водорода при участии очень активного радикала (НО•) или определенных комплексов Fe-O, таких как феррил- или перферрил-радикалы [70]. Обзор термодинамики реакций с участием свободных радикалов приведен в [16], гдепри помощи стандартных одноэлектронных восстановительных потенциалов (Е0') рассчитал иерархию или «порядок клевания» процессов, протекающих при участии свободных радикалов («Порядок клевания» (peskingorder) – термин, используемый при описании иерархических структур по аналогии с порядком клевания курицами зерна из кормушки в соответствии с их местом в куриной иерархии. – Примеч. перев).
Любое окисленное соединение (высокое значение Е0') способно отделить электрон (или атом водорода) от любого восстановленного соединения (низкое значение Е0'), находящегося ниже в иерархическом списке, если реакция кинетически осуществима [16]. Таким образом, НО•, который находится на вершине порядка клевания (Е0'= +2310 мВ) считается самым сильным оксидантом биологических систем и может окислять все более восстановленные соединения, расположенные ниже него в списке (табл. 16.1); он исключительно эффективен в качестве инициатор перекисного окисления липидов [16, 128]. Движущей силой этой реакции является разность потенциалов (ΔЕ0') окисления двух окислительно-восстановительных полуреакций. Например, пара НО•, H+/Н2Oимеет Е0'= + 2310 мВ, а R•, H+/RH - Е0' = + 600 мВ; ΔЕ0'= +1700:
Формула 16.1 (с. 428).
Возникающий при этом жирный ацильный радикал (R•) быстро реагирует с О2, образуя пероксильный радикал (ROO•):
Формула 16.2 (с. 428).
Константа скорости (k1) этой реакции составляет 3 х 108 моль-1с-1 [16]. Поскольку ROO• сильнее окислен (выше по порядку клевания), чем R• или RH, именно он будет являться окислителем ненасыщенных жирных кислот и продолжать цепную реакцию:
Формула 16.3 (c. 429).
Константа скорости (k2) для этой стадии относительно низка (101 - 102 моль-1с-1) [16]. Гидропероксиды липидов (ROOН), образующиеся в ходе реакции распространения, являются как продуктами процесса перокисления, так и субстратами для дальнейших реакций с Fe2+ и Сu+, в результате которых образуются ROO• и алкоксильный радикал (RO•) [131]. Fe2+ при восстановлении расщепляет ROOН:
Формула 16.4 (с. 429).
ROO• и RO• оба могут инициировать дальнейшие реакции (например, (16.3) и последующие):
Формула 16.5 (с. 429).
Таблица 16.1. Одноэлектронный окислительно-восстановительный потенциал свободных радикалов и антиоксидантов (по [16])
Свободные радикалы и антиоксиданты | Окислительно-восстановительный потенциал (Е0', мВ) |
HO•, H+/H2O | 2310 |
Н3СН2С•, Н+/СН3СН3 | 1900 |
RO•, H+/ROH (алкоксильный радикал) | 1600 |
ROO•, Н+ (ROOH) (пероксильный радикал) | 1000 |
O2•-, 2Н+/Н2O2 | 940 |
ПНЖК, Н+/ПНЖК-Н(R•, H+/RH) | 600 |
Урат•, Н+/ Урат-Н | 590 |
Катехол-О•, НТ/Катехол-ОН | 530 |
α-токофероксил•, Н+/α-токоферол | 500 |
Аскорбат•-, Н+/аскорбат | 282 |
Паракват/Паракват•-* | -448 |
* Скорее всего, имеется в виду пируват, поскольку паракват – это токсичный гербицид. – Примеч. науч. ред.
В зависимости от присутствия конкретного гидропероксида RО• также может подвергаться β-расщеплению с образованием алкильных радикалов (R1CH2•) и ряда альдегидов [128]. Альдегиды, включая гексаналь, малоновый диальдегид и 4-гидроксиноненаль, могут вступать в реакции с ε-аминогруппами протеинов и образовывать комплексы, характерные для реакций Майяра. Алкильный радикал имеет более высокий порядок клевания, чем RН или ROOH и может инициировать реакции разветвления цепи, в результате которых образуются этан или пептан – конечные продукты перекисного окисления ПНЖК.
Повышение степени ненасыщенности липидных биомембран или липопротеинов с помощью кормовых добавок увеличивает концентрации лабильных bis-алкильных атомов водорода, повышая вероятность того, что один из этих атомов водорода будет захвачен ROO• или другими радикалами [28, 51, 79, 162]. Скорость окисления ПНЖК пропорциональна количеству непредельных аллильных атомов водорода, присутствующих в данной молекуле ПНЖК [28, 162]. Так, линолеат (18 : 2) с двумя аллильными атомами водорода подвергается окислению в два раза медленнее линолената (18 : 3) с четырьмя аллильными атомами водорода. Кинетическое выражение скорости окисления олефина представляют в виде коэффициента окисляемости (Δ) [162], значение которого равно kp/(2kt)0.5, где kp- константа скорости реакции роста цепи (ROO• + RH > ROOH + R•), a kt – константа скорости реакции гашения (ROO• + ROO• > нерадикальные продукты). Значения окисляемости ПНЖК представлены в табл. 16.2. Таким образом, окисляемость 22 : 6(10 непредельных аллильных атомов водорода) в пять раз выше по сравнению с 18 : 2 (два непредельных аллильных атома водорода).
Таблица 16.2. Значения окисляемости ПНЖК с различным числом непредельных аллильных атомов водорода. По [28, 162]
ПНЖК | Обозначение | Н* | Δ**= kp/(2kt)0.5 |
Линолеат | 18:2 | 2 | 20 ±0,2 |
Линоленат | 18:3 | 4 | 41 ±2 |
Арахидонат | 18:4 | 6 | 55 ±2 |
Докозагексаенат | 18:6 | 10 | 102 ±2 |
* Количество непредельных аллильных атомов водорода.
** Δ – коэффициент окисляемости.