К основным этапам создания заквасок относятся следующие:

• выделение, идентификация и исследование свойств чистых культур в зависимости от назначения;
• создание комбинированных заквасок, изучение взаимодействия микроорганизмов;
• разработка консорциумов;
• проверка стабильности заквасок в лаборатории на производстве;
• внедрение в производство;
• совершенствование закваски.

Промышленное производство сухих заквасок прямого внесения включает следующие процессы:

• выращивание молочнокислых бактерий в обогащенных питательных средах до максимального накопления биомассы;
• концентрирование клеток (отделение их от питательной среды на суперцентрифугах или путем микрофильтрации);
• сушка в защитной среде (сублимационная в лотках или флаконах) до содержания влаги менее 3,5%;
• фасовка закваски.

Питательной средой для выращивания молочнокислых бактерий является молочная сыворотка с добавлением кукурузного экстракта (или аминокислотно-микроэлементно-витаминного комплекса), буферных солей и стимуляторов роста. В качестве буферных солей используют цитрат натрия или ацетат натрия. Стимуляторами роста молочнокислых бактерий являются сульфат марганца, аскорбиновая кислота и др.

Молочнокислые бактерии различаются по потребности в стимуляторах роста, поэтому для выращивания мезофильных молочнокислых бактерий, термофильных молочнокислых стрептококков и молочнокислых палочек используются различные питательные среды.

При приготовлении среды в сыворотке устанавливают рН 4,5-4,6 (оптимальную для выделения белков), нагревают ее до 95°С и выдерживают 60 мин для более полного выделения белков. После этого сыворотку осветляют путем сепарирования. В осветленную сыворотку добавляют компоненты среды согласно рецептуре, устанавливают рациональный уровень рН, стерилизуют при 0,05 МПа (112°С) в течение 60 мин и охлаждают до температуры, оптимальной для роста микроорганизмов.

Стерилизация и охлаждение питательной среды, а также наращивание клеток молочнокислых бактерий осуществляются в ферментере, имеющем мешалку, в котором автоматически регулируются температура и рН на заданном уровне.

В подготовленную стерильную среду, охлажденную до оптимальной температуры развития того или иного вида молочнокислых бактерий, подают закваску в количестве 5-8% (на сывороточной среде) или 3-5% (на обезжиренном молоке).

Наращивание клеток мезофильных молочнокислых бактерий ведут в ферментере при температуре 30°С в течение 10-12 ч, термофильных молочнокислых стрептококков и ацидофильных и болгарских палочек - при 40°С на протяжении 8-9 ч при автоматическом поддерживании рН. При этом рН куль- туральной жидкости достигает для лактококков и стрептококков 6,5-6,8, а для ацидофильных и болгарских палочек 5,7-6,0. После окончания выращивания культуру охлаждают до 3-8°С и направляют на бактофугирование для получения концентрированной бактериальной массы.

Отделение клеток от среды осуществляют в конце логарифмической фазы роста, когда в 1 см³ культуральной жидкости содержатся сотни миллионов - единицы миллиардов активных клеток. Для концентрирования биомассы можно использовать бактофугу или ультрафильтрационную установку.

Концентрированная бактериальная масса содержит сотни миллиардов клеток в 1 см³; выход концентрированной биомассы составляет 0,5-0,8%. Полученную бактериальную массу смешивают с защитной средой в соотношении 1:2-1:4. На отечественных биофабриках в составе защитной среды для мезофильных молочнокислых бактерий применяют: обезжиренное молоко с содержанием 16% сухих веществ- 30 и 70% водного раствора, содержащего сахарозу (5%), желатозу (5%), цитрата натрия (5%), глутамата натрия (2%). В состав защитной среды для ацидофильной палочки вместо цитрата натрия вносят 5% уксуснокислого натрия. Защитная среда для термофильного стрептококка включает 20% обезжиренного молока и 80% водного раствора, содержащего по 2,2% сахарозы, желатозы (желатин после стерилизации под давлением 0,15 МПа в течение 2,5-3,0 ч), лимоннокислого натрия и 1,2% глутамата натрия.

Полученную суспензию клеток молочнокислых бактерий высушивают. Для этого ее разливают на лотки слоем 6-8 мм или фасуют по 2 см во флаконы. Суспензию высушивают в установке для сублимационной сушки сначала при низкой отрицательной температуре -35...-45°С, досушивание проводят при положительной температуре 40-45°С. Продолжительность сушки суспензии на лотках 6-12 ч, во флаконах 24-42 ч. Сухую концентрированную закваску, высушенную на лотках, размельчают и фасуют в специальный многослойный полимерный материал. Сухая концентрированная закваска содержит от 150 до 300 млрд клеток в 1 г. Массовая доля влаги в сухой закваске не должна превышать 3,5%. Допускается наличие посторонней непатогенной микрофлоры не более 10 клеток в 1 г.

Продолжительность свертывания молока при внесении одной порции сухой концентрированной закваски на 1 дм³ молока при оптимальной температуре составляет: у лактококков 4,0-5,5 ч, у термофильных молочнокислых стрептококков 3,0-4,5, у ацидофильных палочек 2,5-3,5 ч.

Срок хранения сухой концентрированной отечественной закваски при температуре 3-10°С составляет 8 мес. со дня выработки.

Сухие закваски, приготовленные без процесса концентрирования бактериальной массы, по составу микрофлоры идентичны сухой концентрированной закваске, но отличаются по количеству клеток молочнокислых бактерий. Сухие бактериальные закваски (неконцентрированные) содержат примерно в 100 раз меньше бактериальных клеток, чем сухие концентрированные закваски (закваски прямого внесения). Жидкие закваски готовят на стерильном обезжиренном или цельном молоке. Молоко стерилизуют в течение 10-15 мин при температуре 121°С, охлаждают до 37±1°С и для проверки на стерильность термостатиру- ют при этой температуре в течение двух суток. Перед заквашиванием молоко контролируют микроскопированием окрашенного препарата. При просмотре не менее чем в 10 полях зрения микроскопа должны отсутствовать вегетативные клетки и споры.

После этого в молоко вносят комбинацию культур и выдерживают его при оптимальной температуре развития до образования сгустка. Закваску фасуют в стеклянные флаконы по 20, 50 и 100 см³, флаконы укупоривают и маркируют (этикетируют). Жидкие закваски имеют срок годности 10 суток при 3- 8°С и 5 суток при комнатной температуре хранения.

Закваска имеет жидкую консистенцию с небольшой крупкой, реже - сметанообразную. Допускается отделение сыворотки. Вкус и запах закваски кисломолочные, характерные для соответствующего вида, освежающие, без посторонних привкусов и запахов. Цвет белый с кремовым оттенком по всей массе. Допускается буроватый оттенок. Кислотность 80-100°Т. При микроскопии мазков из закваски должны отсутствовать инволюционные формы и посторонние микроорганизмы.

При производстве заквасок бактериальные клетки могут наращивать численность в периодическом режиме или в условиях непрерывного (проточного) культивирования.

При периодическом выращивании (в изолированной емкости) действующие на микроорганизмы многочисленные факторы меняются по ходу развития культуры. Вначале микроорганизмы размножаются в условиях избытка питательных веществ. Одновременно с этим в среде накапливаются продукты обмена. Они тормозят деятельность ферментов, участвующих в синтезе компонентов клеток. В соответствии с происходящими в среде изменениями культура сама претерпевает ряд закономерных морфобиохимических изменений. Так, например, клетки, образовавшиеся в начале культивирования, отличаются от клеток, выросших позднее. Это ведет к гетерогенности культуры.

Наращивание клеток в условиях непрерывного культивирования предусматривает постоянный приток питательной среды и одновременное удаление продуктов жизнедеятельности. В результате этого микроорганизмы приобретают способность к продуктивному незатухающему во времени росту, что дает возможность получить более активную закваску, а также увеличить выход продукции с существующего оборудования.

Процесс получения натуральных кефирных грибков включает подготовку молока, культивирование кефирных грибков, отделение, фасование, укупоривание, маркирование и хранение. Для культивирования кефирных грибков используют обезжиренное молоко, пастеризованное при температуре 92-95°С в течение 20-30 мин, в которое помещают грибки в соотношении 1:20-1:40. Выращивание проводят при температуре 18-22°С. Ежедневно молоко меняют, т. е. грибки заливают свежими порциями питательной среды. Молоко, в котором культивировались кефирные грибки, представляет собой уже культуральную кефирную закваску (слив с кефирных грибков), содержащую почти ту же микрофлору, что и кефирный грибок.

По мере роста грибков 1-2 раза в неделю их отделяют от закваски, фасуют порциями в стерильные флаконы, заливают обезжиренным молоком или сывороткой. Срок хранения кефирных грибков составляет 7-10 дней при температуре 8-10°С.

Сухие кефирные грибки получают из натуральных (живых) кефирных грибков путем высушивания в защитной среде. На отечественных биофабриках чаще всего в качестве защитной среды применяют молочную сыворотку с добавлением 0,5% сахара и 0,01% аскорбиновой кислоты. Отделенные от культу- ральной закваски грибки помещают в защитную среду в соотношении 1:20 и выдерживают в ней 5-6 ч при температуре 20-22°С для наращивания дрожжей, которые являются наиболее чувствительными к замораживанию и высушиванию. После этого грибки отделяют от защитной среды, укладывают на стерильные лотки слоем 8 мм, закрывают стерильной марлей и помещают в морозильный шкаф при температуре -20...-25°С на 1,5-2 ч. Грибки сушат в установке сублимационной сушки. Температура в начале сушки 15-20°С, конечная температура досушивания 30-35°С. Продолжительность сушки 8-10 ч.

Сухие кефирные грибки фасуют порциями по 10, 20, 50,100 г в пакеты из многослойного полимерного материала, например полиэтилен-целлофана, и запаивают. Срок хранения кефирных грибков составляет 3 мес. при температуре не выше 8°С. Сухие кефирные грибки содержат не более 4,5% влаги.

Продолжительность сквашивания молока при соотношении грибка и молока 1 : 40 и температуре 18-22°С для натуральных грибков составляет 16-18 ч, для сухих - 24-28 ч. Кислотность сгустка 90-110°Т. В микроскопическом препарате наблюдаются диплококки, короткие цепочки, единичные палочки и клетки дрожжей. При возникновении пороков кефирной закваски или разногласии в ее оценке проводят контроль качественного состава микрофлоры в соответствии с Технологической инструкцией по приготовлению и применению заквасок для кисломолочных продуктов.