Прогностические модели обычно создаются на основе хорошо воспроизводимых лабораторных исследований, базирующихся на определенных видах микроорганизмов в жидкой среде, которая обеспечивает хороший рост целевой микробиоты. Впоследствии эти данные используют для прогнозирования роста штаммов (пли даже видов или родов микроорганизмов в случае общих моделей порчи) в широком диапазоне пищевых продуктов при различных условиях. Поэтому неудивительно, что при практическом использовании все модели имеет те или иные недостатки. Для корректного применения и интерпретации моделей необходимо понимать причины расхождения между моделью и измеряемыми показателями, а также иметь возможность определить наиболее вероятных из них для исправления ошибки. Это позволит наилучшим образом использовать уже собранные данные, организовать дополнительный их сбор и усовершенствовать методы моделирования.

Хотя ограничения моделей широко обсуждаются в специальной литературе, многие аспекты их ограничения относятся к другим методам, используемым микробиологами-пищевиками, в частности, к методам тестирования сроков хранения и провоцирующих тестов. Такие методы важны и обычно позволяют определить поведение микроорганизмов непосредственно в пищевом продукте и учесть все факторы, влияющие на их рост. Результаты, однако, зачастую базируются на относительно небольших объемах экспериментальных данных и могут применяться только для конкретных условий проведения испытаний. На практике многие микробиологи-пищевики используют прогностические модели лишь для определения возможной реакции того или иного микроорганизма на условия окружающей среды с последующим подтверждением результатов провоцирующим тестированием.

Существует несколько причин «отказа» модели, и связаны они с процессами валидизации или верификации.

10.4.1. Проблемы валидизации

Если получены неудовлетворительные результаты валидизации (то есть модели не соответствуют данным, которые использовались при их разработке), то такие модели исследует подвергать верификации. Причинами неудовлетворительной валидизации могут быть исходные данные и примененные методы моделирования.

Исходные данные

Данные должны представлять весь диапазон моделируемых условий. Если исследовалось недостаточное количество условий среды, особенно в областях, оказывающих существенное влияние на поведение микроорганизмов (то есть вблизи границ роста), то такая модель может и не отражать наблюдаемую реакцию. Для большинства кинетических моделей роста микроорганизмов необходим хороший контроль содержания инокулята или следует использовать технику моделирования, позволяющую учитывать вариативность данных. Как правило, содержание инокулята составляет 102-104 КОЕ/мд (или КОЕ/г). Такое его содержание позволяет получить хорошую оценку численности микроорганизмов в начальных фазах с помощью традиционных методов и обеспечивает длительный период экспоненциального роста. Если содержание инокулята слишком высоко, то микроорганизмы до перехода в стационарную фазу могут не полностью войти в экспоненциальную фазу роста, так что его оценка окажется неправильной, В случае слишком низкого содержания инокулята оценка лаг-фазы может оказаться заниженной, поскольку для охвата всего диапазона вариативности, ожидаемого в этот период, будет присутствовать слишком мало клеток [60]. Некоторые модели основаны на времени начала помутнения или достижения определенной оптической плотности. В этих случаях время достижения порогового значения зависит не только от условий среды, но и от содержания инокулята, то есть при идентичных условиях время обнаружения может меняться в зависимости от содержания инокулята. Такие модели обычно не позволяют корректировать начальную концентрацию инокулята, в связи с чем применять их следует с большой осторожностью. Некоторые рекомендации по сбору данных для кинетического моделирования роста микроорганизмов приведены в работе [68].

Методы моделирования

Выбор модели может существенно влиять на процесс валидизации. Для точного определения параметров кривой роста микроорганизмов во многих первичных моделях большое значение имеет количество и выбор данных для каждого исследуемого условия среды. Считается, что кривая роста должна иметь по крайней мере 8 точек данных, а их расположение должно обеспечить определение основных точек перегиба кривой (то есть окончание лаг-фазы, середину и конец экспоненциальной фазы роста). Для одностадийных моделей это не так важно (при условии, что весь набор данных содержит достаточное количество точек). Выбор первичных (например, Gompertz и Logistic) и вторичных (полиномиальной, корнеквадратичной) моделей влияет на их способность описывать экспериментальные данные, так как все модели основаны на определенных предположениях. И наконец, методы, используемые для определения параметров моделей, могут зависеть от начальных значений, применяемых в программах оптимизации, которые, в свою очередь, могут находить не самое лучшее решение.

Неудача на стадии валидизации модели зачастую обусловлена плохой сходимостью метода при поиске оптимального решения или низкой степенью согласованности с экспериментальными данными. Даже если статистическая согласованность модели оказывается достаточной, для визуального сравнения прогнозируемых значений с исходными данными и проверки наличия биологического смысла рекомендуется использовать графическое представление (двух- или трехмерное).

10.4.2. Проблемы верификации

Даже если модель хорошо отражает данные, использовавшиеся при ее создании, из этого еще не следует, что она применима в других ситуациях. Существует несколько причин неудовлетворительной верификации модели в других условиях – они могут быть связаны с исходными данными модели, с данными, используемыми для верификации, а также с наличием дополнительных факторов, не представленных в модели.

Исходные данные

Исходные данные получают при изучении единственного штамма микроорганизмов или смеси микроорганизмов разных штаммов, видов и даже родов. Выбор микроорганизма(ов) очень важен. Если они выделены из среды, сильно отличающейся от типовой среды пищевого продукта, то их поведение в продукте может значительно отличаться. И наоборот, если штамм(ы) выбраны по критерию их стойкости к условиям среды, то их реакция может допускать значительно более быстрый рост по сравнению с ожидаемым. Модели для патогенных микроорганизмов зачастую основаны на «безопасном» подходе, который не всегда полезен для моделей порчи пищевых продуктов, так как может приводить к чрезмерному занижению срока хранения пищевого продукта по микробиологическим показателям. Хотя модели порчи могут быть построены на разных штаммах (видах, родах) микроорганизмов, их выбор должен отражать конкретную микрофлору, являющуюся основной причиной порчи. Если, например, в случае порчи рыбы в модели отсутствует основной вызывающий порчу микроорганизм (в частности, Shewenella putrefaciens),то прогноз, скорее всего, будет неудачным.

Обычно принято считать, что скорость роста микроорганизмов зависит от условий среды. Тем не менее период лаг-фазы или h0 (работа, которая должна быть выполнена перед началом размножения микроорганизмов, [55]), зависит не только от существующих условий среды, но и от фазы роста на момент инокуляции [74], степени повреждения клеток [64] и предыдущих условий роста [69, 74]. Установлено, что h0 с увеличением разницы температур между исходными и текущими условиями роста возрастает линейно [23]. В результате верификация длительности лаг-фазы обычно бывает неудовлетворительной и зачастую не публикуется. Поэтому при верификации модели вместо длительности лаг-фазы иногда используют время достижения определенного увеличения численности микроорганизмов (например, Т1000). Некоторые системы моделирования третьего уровня позволяют получать прогнозы без длительности лаг-фазы (которые могут быть вполне адекватными, если целевой микроорганизм хорошо адаптируется к конкретной среде) или изменять ее длительность исходя из практического опыта.

В экстремальных условиях размножение микроорганизмов более вариативно [14, 43]. Хотя результаты валидизации модели, разработанной на данных, полученных в экстремальных средовых условиях, могут быть вполне удовлетворительным и, однако верификация на других подробных данных может оказаться уже неудовлетворительной (вследствие вариативности микробиологический реакций) даже при повторении опытов в той же самой лаборатории в идентичных условиях. Значимость проблемы можно определить путем использования при разработке модели повторных данных, особенно вблизи границ роста. Если выяснится, что воспроизводимость результатов неудовлетворительна (по результатам анализа графиков измеренных значений относительно прогнозируемых или относительной ошибки RE для каждого условия), то одним из решений может стать удаление данных вблизи границ и повторное построение модели на оставшихся данных. В этом случае область интерполяции сужается, но зато полученная модель окажется более надежной.

Данные, используемые для верификации

Явно отрицательные результаты верификации иногда отражают качество используемых данных. Например, если использованы опубликованные данные, то при их получении могли быть замерены не все условия среды, и некоторые из них приходится оценивать заново, а анализируемые микроорганизмы могли выбираться но иным причинам. В случае моделей порчи микробиота конкретных пищевых продуктов в различных странах бывает разной в зависимости от сырья и местных условий. В многокомпонентных пищевых продуктах поведение микроорганизмов может отражать их рост лишь в некоторой части пищевого продукта, а анализ условии среды (например, значений рН или αω)мог быть сделан для всего продукта. Некоторые модели формально учитывают αω, но в действительности они разработаны при использовании одного конкретного гигроскопического вещества (увлажнителя), зачастую NaCl, и это трансформировалось в значение αω. Если верифицировать такие модели на данных, полученных при использовании другого увлажнителя, то степень согласованности модели с этими данными оказывается совершенно неудовлетворительной, особенно в области низких значений αω.

Влияние дополнительных факторов

Из-за наличия факторов, не представленных в модели, последнюю иногда вообще не подвергают верификации на некоторых типах пищевых продуктов. Реальные пищевые продукты намного сложнее экспериментальных бульонов – в них работают и другие факторы, влияющие на рост микроорганизмов – в частности структура продукта, наличие дополнительных противомикробных системы (естественно присутствующих или внесенных консервантов, кислот, различный состав газовой среды при хранении) и присутствие микроорганизмов-конкурентов. Все эти факторы обычно делают прогностические модели более безопасными. Кроме того, во многих моделях определен диапазон условий, использовавшихся при их создании. Несмотря на то что зачастую предполагается пригодность всех комбинаций условий для верификации, в действительности область интерполяции (МСР) модели может оказаться значительно меньше, и, соответственно, результаты верификации модели оказываются неудовлетворительными. Здесь очень важен выбор подкислителя. При разработке многих моделей используют соляную (хлороводородную) кислоту, тогда как в рецептуру пищевых продуктов входят органические кислоты, вносящие свой вклад в значение рН, не учтенный в модели.

Процесс верификации зачастую имеет целью определить границы области применения модели. Области, в которых верификация дает не очень хорошие результаты, очень важны для определения будущих направлений экспериментов.