Совокупность характеристик, отражающих по­требности дрожжевых организмов в определенных физи­ко-химических условиях среды, относят к физиологиче­ским признакам. Из этих признаков для целей идентифи­кации используют следующие: спо­собность к сбраживанию сахаров до углекислого газа и этанола в анаэробных усло­виях (брожение), усвоение безазотистых источников угле­рода путем их окисления в аэробных условиях (ассимиля­ция), потребление различных источников азота, рост на среде без витаминов, максимальные для роста температу­ры, способность расти при повышенном осмотическом дав­лении среды и пр. В технологическом смысле все перечис­ленные свойства имеют большее или меньшее значение.

Общими требованиями при проведении физиологиче­ских тестов являются использование при этом свежих (обычно 1–2-суточных) активно растущих культур дрож­жей, высокоочищенных препаратов веществ, не содержа­щих примесей, которые могут обусловить ложные резуль­таты, и культивирование организмов при оптимальных для их роста температурах.

 

12.1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИНТЕНСИВНОСТИ БРОЖЕНИЯ И ДЫХАНИЯ

Уровни интенсивности дыхания (Q_O2) и интен­сивности брожения (Q_CO2) измеряют у молодых клеток, ис­следуемых на одной стадии развития, культивируемых на одной и той же синтетической среде, содержащей глюкозу и полной с точки зрения содер­жания мине­ральных и азот­содержащих веществ, а также витаминов. Измерения про­изводят на при­боре для опре­деления энергии дыхания и брожения микроорганизмов Одинцовой (рис. 28) или ма­нометрическим способом на аппарате Варбурга (рис. 29) для газообмена.

Рис. 28
Прибор Одинцовой:

1 – бродильный сосуд; 2 – соедини­тельная трубка; 3 – бюретка;
4 – уравнительный сосуд; 5 – трехходо­вой кран.

 

Рис. 29
Аппарат Варбурга:

а – исходное положение манометра; б – из­мер­ение интенсивности дыха­ния;
в – изме­рение интенсивности брожения.

В аппарате Варбурга и в приборе Одинцовой газомет­рическая часть состоит из тонких стеклянных трубок с делениями, снабженных при­шлифованными кранами, по­зволя­ющими регистрировать выделяющийся углекислый газ (брожение) и поглощение кислорода (дыхание) дрож­жами определенной массы в течение короткого времени.

Подготовка культуры. Чашки Петри с богатой пита­тельной средой (сусло-агар с 0,3% дрожжевого автолизата) засевают эксперименталь­ными расами.

Через 5–7 суток культи­вирования в термостате посев смывают с чашек стерильной водой, отфильтровывают и промывают также водой на воронке Бюхнера, затем от­прессовывают между листи­ками фильтровальной бума­ги, и берут по весу для приго­товления суспензии.

Брожение проводят с 2% отпрессованных дрожжей на 4%-ном растворе глюкозы в буферной смеси по Мак-Ильвейну (лимонная кислота и двухосновный фосфорнокис­лый натрий в концентрации 1/20 моля). Сахарный рас­твор вносится в боковую ампулу.

Для определения дыхания используют 0,5% отпрес­сованных дрожжей и одно­процентный раствор сахара (можно готовить из суспензии, приготовленной для опре­деления брожения).

Длительность опытов – 2 ч при температуре 28°С.

Показатель количества углекислого газа в см³, выде­ленного за 1 ч на 1 мг дрожжей (может быть в атмосфере СO₂ или другого инертного газа) обозначают Q_CO2; показа­тель количества кислорода в см³, поглощенного за 1 ч на 1 мг дрожжей, обозначают Q_O2.

Дрожжи по этим показателям различаются:

• только окисляющие;
• обладающие равной интенсивностью и дыхания, и бро­жения;
• имеют достаточно высокую окислительную способ­ность и малоактивны по брожению;
• интенсивность брожения высокая при относительно низкой интенсивности дыхания;
• слабая интенсивность дыхания и не очень высокая бро­жения.

Для характеристики истинных бродильных свойств различных рас производственных дрожжей используют коэффициент – отношение интенсивности брожения к интен­сив­ности дыхания (Q_CO2/Q_O2). Чем выше этот пока­затель, тем выше энергия брожения расы дрожжей в оп­ределенных условиях.

Работая на этих аппаратах, удобно вести исследования по влиянию условий культивирования дрожжей и воздей­ствию факторов роста и активаторов брожения.

Процентное содержание дыхательного фермента клет­ки изменяется в зависимости от степени аэрации питатель­ной среды. В противоположность этому интенсивность сбра­живания является относительно постоянной в течение все­го периода брожения и снижается только к его концу, когда число живых клеток уменьшается. Интенсивность сбраживания выражают в мм³ газа на 1 мг дрожжей в час.

Лафон разделил дрожжи по этому признаку на шесть групп.

1. Дрожжи только окисляющие. Debaryomyces, выде­ленные из вин, и С. vini не вызы­вают сбраживания саха­ров или сбраживают их только в виде следов. Интенсив­ность дыхания равна примерно 25.
2. P. fermentans и Н. anomala имеют интенсивность дыхания, часто равную и иногда превосходящую интен­сивность сбраживания.
3. M. pulcherrima имеет достаточную окислительную способность и малоактивна с точки зрения сбраживания. Отношение дыхания к брожению равно 30:90.
4. Для Sacch. bailii дыхание составляет от 13 до 18%. В эту же категорию входят виды Hanseniaspora. Интен­сивность сбраживания составляет от 100 до 150 при ин­тенсивности дыхания от 15 до 20.
5. У рода Saccharomyces отношение дыхания к броже­нию всегда ниже 10% при интен­сивности брожения от 200 до 300. Такие же данные и у Torulopsis stellata при не­сколько более слабой интенсивности брожения.
6. Brettanomyces – дрожжи с замедленным метаболиз­мом, имеют слабую интен­сив­ность дыхания при интенсив­ности сбраживания около 50.

 

12.2. СБРАЖИВАНИЕ САХАРОВ

Для описания и идентификации микроорганиз­мов широко используют некоторые особенности их обмена веществ, выявляемые по способности изучаемого организ­ма расти на принятых в настоящее время диагностических средах и вызывать те или иные превращения веществ, вхо­дящих в состав этих сред. Эмпирически давно отмечено, что немало характеристик дрожжей, в том числе и физио­логических, взаимосвязаны. Подобные корреляции полез­но помнить, так как они могут служить дополнительным контролем и предостеречь от грубых ошибок. Примени­тельно к сбраживанию сахаров наиболее общими являют­ся два правила:

• если дрожжи сбраживают какой-либо сахар, то они могут сбраживать и глюкозу;
• если дрожжи сбраживают какой-либо сахар, то они могут также его ассимилировать. Обратное – неверно.

Рис. 30
Накопление газа в поплавке:

1 – рост культуры со­провождается обра­зо­­ванием газа;
2 – газ не образуется.

Наиболее простыми и общедоступными для установле­ния способности дрожжей к сбраживанию сахаров являют­ся методы:

• с использованием трубок Дунбара;
• с использованием трубок Дурхэма (поплавков), показанных на рисунке 30;
• посев в столбик полужидкого агара.

Для получения концентрации 2% (раффинозы 4–6%) отдельные сахара растворяют в разведенном в соотноше­нии 1:10 дрожжевом автолизате или в 0,5%-ном растворе дрожжевого экстракта. Использование в качестве раство­рителя дрожжевой воды не рекомендуется, поскольку она часто содержит значи­тельные количества трегалозы, ко­торая может сбра­живаться дрожжами.

Чтобы обнаружить изменение рН, к среде добавляют инди­катор – бромкрезоловый пурпурный – из расчета 2 см³ 1,6%-ного спиртового раствора на 1 л среды. При рН 6,8 индикатор имеет пур­пурный, а при рН 5,2 – желтый цвет. Можно использовать в такой же концен­трации бромтимоловый голубой, кото­рый при рН 6,0 желтого, а при рН 7,6 синего цвета.

С использованием трубок Дунбара. Растворы сахаров разливают по трубкам Дунбара и автоклавируют 15 мин при 112°С. При этом в слепом колене труб­ки нередко образуются пузырьки возду­ха. Перед засевом, осторожно наклоняя трубку, их необходимо удалить. Посев производят культурами с сусло-агара или 0,1–0,2 см³ суспензии клеток иссле­дуемых дрожжей. Инкубация длится от 24 ч до 10 суток.

О способности к сбраживанию сахара свидетельствует образование газа в закрытом колене трубки.

С использованием поплавков. Приготовленные раство­ры сахаров разливают по пробиркам на 1/2 объема, в ко­торые для определения газообразования опускают поплав­ки запаянным концом вверх (трубочки, диаметром 5–7 мм, длиной 35–45 мм, запаянные с одного конца). Горлышко пробирки закрывают большим пальцем и, осторожно пе­реворачивая, заполняют поплавок жидкой средой. Про­бирки закрывают ватно-марлевыми пробками и автоклавируют 20 мин при 0,1 МПа. После автоклавирования сре­да из поплавков вытесняется, но по мере охлаждения поплавки снова заполнятся.

Посев производят культурами с сусло-агара или 0,5–1,0 см³ суспензии клеток иссле­дуемых дрожжей.

При необходимости соблюдения анаэробных условий инкубирования, после посева поверхность среды залива­ют стерильным парафином, стерильным вазелиновым мас­лом или их стерильной смесью 1:1.

Инкубация длится от 24 ч до 10 суток.

О способности к сбраживанию данного углевода сви­детельствует газообразование и вытеснение питательной среды из поплавка.

Посев в столбик полужидкого агара. В приготовлен­ные растворы сахаров вносят 0,5% агара, 0,3% дрожже­вого автолизата, кипятят до полного растворения, разли­вают в пробирки на 1/2 объема, автоклавируют 20 мин при 0,1 МПа. Из автоклава пробирки переносят в штатив и выдерживают вертикально до полного охлаждения.

Посев производят бактериологической иглой уколом до дна пробирки культурами с сусло-агара или суспензии клеток исследуемых дрожжей.

При необходимости соблюдения анаэробных условий инкубирования после посева поверхность среды заливают стерильным парафином, стерильным вазелиновым маслом или их стерильной смесью 1:1.

Инкубация длится от 24 ч до 10 суток.

О способности к сбраживанию данного углевода сви­детельствует газообразование и разрывы столбика полужидкого агара. Для учета полученных результатов мож­но использовать таблицу 13.

Таблица 13

Показатели роста исследуемых культур дрожжей на средах с углеводами и спиртами

Микроорганизмы характеризуются неодинаковой спо­собностью использовать различные углеводы и спирты в качестве единственных источников углерода и энергии. Перечень сахаров и других органических соединений, спо­собность к сбраживанию (либо ассимиляции) которых оп­ределяют при идентификации дрожжей, включает:

________________________

Трисахариды

* Используются в тестах как на ассимиляцию, так и на брожение.

 

Таблица 14

Возможные варианты сбраживания раффинозы дрожжами

 

Рис.31
Структура молекулы раффинозы

Из перечисленных углеводов специального рассмотре­ния требует раффиноза, поскольку этот трисахарид мо­жет по-разному сбраживаться дрожжами: полностью, на 2/3 или же на 1/3 молекулы, что учитывается при иден­тификации (табл. 14). О том, насколько полно и каким образом сбраживается раффиноза исследуемыми дрожжа­ми, можно судить по способности к сбраживанию саха­ров, входящих в состав молекулы раффинозы (рис. 31), или определением остаточных сахаров в среде.

 

12.3. ИЗБИРАТЕЛЬНОЕ СБРАЖИВАНИЕ ГЛЮКОЗЫ И ФРУКТОЗЫ

Известно, что в присутствии смеси глюкозы и фруктозы, такой как инвертный сахар, дрожжи сбражива­ют прежде всего глюкозу и после этого поглощают фрукто­зу. Но неко­то­рые дрожжи ведут себя по-другому. При расче­те процентного содержания сброженной глюкозы, когда 50% фруктозы уже сброжено, различают три категории дрожжей:

1. Дрожжи, сбраживающие к этому моменту от 80 до 85% глюкозы. Это наиболее многочисленные, глюкозофильные дрожжи. К этой категории относится большая часть видов Saccharomyces, а также Saccharomycodes и Brettanomyces.
2. Дрожжи, которые предпочтительно поглощают фрук­тозу или фруктозофильные; они используют в этих усло­виях только от 5 до 10% глюкозы. Их представляют три вида: Sacch. bailii, Sacch. roxii и Т. stellata.
3. Дрожжи, разлагающие оба сахара с почти одинако­вой скоростью, во всяком случае с начала брожения. К мо­менту, когда они поглощают половину фруктозы, исчеза­ет от 40 до 60% глюкозы. В эту категорию входит восемь видов дрожжей, в том числе виды Hanseniaspora.

 

12.4. ЗИМАЗНАЯ, ИНВЕРТАЗНАЯ И МАЛЬТАЗНАЯ АКТИВНОСТЬ

Зимазная, инвертазная и мальтазная актив­ность – основные с технологической точки зрения пока­затели ферментативной активности дрожжей.

Например, для оценки качества хлебопекарных дрож­жей приняты показатели ферментативной активности, представленные в таблице 15.

 

12.4.1. ГАЗОМЕТРИЧЕСКИЙ СПОСОБ

По скорости сбраживания дрожжами глюкозы, са­харозы и мальтозы определяют соответственно зимазную, инвертазную и мальтазную активность, выражае­мую во времени, необходимом для выделения 10 см³ СO₂ из 5%-ного раствора сахара. Для определения пользуются микрогазометром системы Елецкого (см. рис. 32), изготов­ляемым на месте.

 

Прибор состоит из стаканчика 1 и манометрической крышки, соединяемых при помощи шлифованной поверх­ности. Диаметр стаканчика (внутренний) равен 50 мм, высота – 60 мм. Манометрическая крышка состоит из чашки 2 диаметром (внешний) 50 мм, высотой 25 мм и изме­рительной трубки 3 высотой 250 мм и внутренним диаметром 8–10 мм. В мано­метрической крышке имеется изогнутая газоотводная трубка 4 внутренним диамет­ром 3 мм с трехходовым краном 5, при помощи которого газо­отводная труба сое­ди­няется как с внутренней камерой га­зо­ме­ра – стаканчиком, так и с внешней средой.

Перед началом работы в мано­метри­ческую крышку заливают насыщенный раствор поваренной соли, подкра­шенный метиленовым синим. Раствор наливают до осно­вания измерительной трубки, и этот уровень принимают за ноль, все шлифы смазывают вазелином.

Измерительную трубку градуируют с точностью до 1 см³. Высоту h 1 см³ на измерительной трубке вычисля­ют по следующей формуле:

где r – радиус измерительной трубки, см³, r = 4 мм.

Подставив это значение в формулу, получим

0,5 г прессованных товарных дрожжей, или отпрессо­ванных на воронке, или снятых с поверхности плотной агаризованной среды, помещают в стаканчик прибора, заливают 10 см³ водопроводной воды температурой 35°С и размешивают. К полученной суспензии добавляют 10 см³ 10%-ного раствора сахара (глюкозы, сахарозы или маль­тозы) и быстро закрывают стаканчик манометрической крышкой, предварительно переведя трехходовой кран 5 в положение А. Затем кран переводят в положение Б для выравнивания давления внутри прибора с атмосферным давлением. После этого кран переводят в положение В и прибор помещают в термостат при температуре 35°С, за­секают время и наблюдают за прибором, пока не выделит­ся 10 см³ диоксида углерода и жидкость в измерительной трубке не поднимется на соответствующую высоту. Вре­мя, затраченное на выделение 10 см³ газа, выраженное в минутах, называют зимазной, инвертазной или мальтазной активностью при использовании соответственно глю­козы, сахарозы или мальтозы.

После окончания анализа кран на газоотводной труб­ке переводят в положение Б, чтобы жидкость в трубке опустилась, и разъединяют манометрическую трубку и стаканчик. Из стаканчика выливают жидкость, ополас­кивают его водой и вытирают досуха.

 

12.4.2. МАНОМЕТРИЧЕСКИЙ СПОСОБ***

Для определения ферментативной активности предла­гается прибор (см. рис. 22), состоящий из колбы (100–120 см³), газоотводной трубки с краном и чувствительно­го манометра (медицинский, для измерения артериально­го давления).

Перед началом работы измерить объем используемой колбы до нижнего края тщательно притертой резиновой пробки и объем проходящей через пробку газоотводной трубки. Для этого заполнить колбу и трубку водой, а за­тем измерить объем вместившейся жидкости мерным ци­линдром. Полученную величину нанести на колбу и в даль­нейшем использовать как «постоянную».

В колбу поместить 0,5 г прессованных дрожжей, за­лить 10 см³ водопроводной воды температурой 35°С и раз­мешать до однородной суспензии. Затем добавить 10 см³ 5%-ного раствора сахара (глюкозы, сахарозы или мальто­зы) и закрыть колбу резиновой пробкой с газоотводной трубкой, соединенной с манометром. Для уравнивания давления в колбе с атмосферным давлением извлечь под­вижную часть краника и сразу поместить его на место, тщательно притерев и совместив отверстия. Подготовлен­ный таким образом прибор поместить в термостат при 35°С (308 К) и регистрировать время, за которое стрел­ка мано­метра достигнет необходимой отметки, соответствующей 10 см³ выделенного углекислого газа.

Величину давления в определенном ранее объеме ис­пользуемой колбы определить по уравнению Менделеева-Клапейрона:

где т – масса газа; М = 44 г; р = 700 мм рт. ст.; R = 62 360 мм рт. ст./моль К; V = 10 см³;
Т  = 308 К.

Тогда

Таким образом, установлено, что в состоянии реаль­ного газа масса 10 см³ диоксида углерода равна 0,016 г.

Для приведения давления газа в условия эксперимен­та формулу (1) преобразовали

где р_х – показание манометра; m = 0,016 г; R = 62 360 мм. рт. ст./моль К; Т = 308 К;
V_х = 104 см³; М = 44 г.

Значение V_х определяется вычитанием объема дрож­жевой суспензии (20,5 см³) из обще­го объема в системе (124,5 см³). Тогда

где р_х – давление, создаваемое газом массой 0,016 г и объ­емом 10 см³ в используемом объеме V_х при температуре Т.

При условии, что в дальнейшей работе значения R, М и т будут использоваться как «постоянные», получится формула

На основании произведенных расчетов установлено, что, используя прибор с постоянным свободным объемом (в при­веденном примере – 104 см³), остается лишь реги­стриро­вать время, за которое стрелка манометра достигнет необ­ходимой отметки (в при­веденном примере – 67 мм рт. ст.).

Если за единицу измерения будет принят 1 Па, данная формула будет представлена как:

 

12.5. ПРОДУКТЫ БРОЖЕНИЯ                  

При брожении наряду с этиловым спиртом и углекислым газом образуется ряд побочных и вторичных продуктов. Эквивалентность между глицерином (Г) и сум­мой других вторичных продуктов: уксусной кислоты (У), янтарной кислоты (Я), 2,3-бутан­диола (Б), ацетоина (А), остаточного свободного ацетальдегида (Э) – с коэффици­ентом при каждом из них, выведенным из химического уравнения, установлена аналитически.

Предложено уравнение, вытекающее из баланса спир­тового брожения Нейберга:

5Я + 2У + Б + 2А + Э = Σ £ Г.

Это уравнение эквивалентности (Σ от 0,8 до 1,0) под­тверждается для всех дрожжей, имеющих только бродильный тип обмена веществ. Для других групп дрожжей это отношение действительно только в условиях абсолютного анаэробиоза и не подходит для среды с доступом воздуха.

Для характеристики рас дрожжей, особенно промыш­ленного назначения, необходимы сведения об образова­нии ими продуктов брожения, имеющих весьма важное значение в формировании конечного продукта.

 

12.6. ПОТРЕБНОСТЬ В ВИТАМИНАХ

Способность дрожжей синтезировать все необ­ходимые для роста витамины или потребность в наличии каких-либо из них в среде используют при идентифика­ции видов в качестве дополнительных характеристик. Нельзя недооценивать и технологическое зна­чение этого фактора.

В некоторых случаях потребность в определенных ви­таминах присуща всем предста­вителям рода. Например, все виды Hanseniaspora, Kloeckera нуждаются в инозите и пантотеновой кислоте. В других родах зависимость по каким-либо витаминам или способ­ность расти на безвита­минной среде характерны для отдельных видов или даже разно­видностей. Наиболее часто дрожжи нуждаются в обеспечении биотином и тиамином.

Постановка теста на способность к росту в среде без витаминов (см. табл. 6) и определение их значения как факторов роста осуществляются аналогично постановке тестов на способность к ассимиляции источников углеро­да. Поскольку дрожжи способны накапливать в клетках значительные количества витаминов, для приготовления инокулята в данном тесте используют культуры дрожжей, предварительно выращенные в без­витаминной среде.

Интенсивность брожения или накопления биомассы на жидких и плотных средах свидетельствует о значении данного витамина как фактора роста для исследуемой культуры дрожжей. Медленный и слабый рост на безви­таминной основе рассматривают как неспособность иссле­дуемых организмов синтезировать все необходимые для роста витамины.

Для всех видов дрожжей, использующихся в промыш­ленности, характерна специфи­ческая потребность в том или ином факторе роста: мезоинозит, биотин, пиридоксин, тиамин, пантотеновая кислота, никотинамид, парааминобензойная кислота.

Для исследований используется безвитаминная среда.

Для каждой культуры готовят восемь пробирок; одна пробирка без факторов роста, другая – получает все, за исключением одного, каждый раз разного. Пробирки за­севают минимальным количеством клеток (1–2 клетки на 1 мм³, микрозасев).

Для анализа опытов используют нефелометрирование, или подсчет клеток в счетных камерах, а также взвеши­вание хорошо укупоренных пробирок.

В результате получают данные как по скорости роста и накопления биомассы, так и по скорости и пределу сбра­живания сахара.

В результате построения витаминограмм можно ото­брать тест-культуры для определения того или иного фак­тора роста – витамина.

 

12.7. РОСТ НА СРЕДАХ С ПОВЫШЕННЫМ ОСМОТИЧЕСКИМ  ДАВЛЕНИЕМ

Под осмотической устойчивостью понимают приобретенную способность некоторых рас и культур дрож­жей сохранять ферментативную активность в средах с от­носительно высоким осмотическим давлением. Это свой­ство следует отличать от осмофильности, которая являет­ся генетически закрепленным признаком отдельных родов и видов дрожжей, обитающих в специфических экологи­ческих условиях.^*** При этом следует понимать, что дрож­жи, устойчивые к высоким осмотическим давлениям, соз­даваемым в среде глюкозой, не всегда так же устойчивы к давлениям, создаваемым солями.

Определить способность культуры сохранять свою жизнедеятельность в средах с высоким осмотическим давлением важно не только для выделения и идентифи­кации осмофильных дрожжей. Данный показатель имеет значение при выборе рас, используемых в производстве хлебопекарных дрожжей, как фактор, влияющий на стой­кость готовой продукции и ее технологические особенно­сти. Кроме того, в последние годы в селекции пивных и спиртовых рас все большее внимание уделяют осмотиче­ской устойчивости, исходя из технологических и эконо­мических предпосылок.

 

12.7.1. ОТНОШЕНИЕ К КОНЦЕНТРАЦИИ ХЛОРИСТОГО НАТРИЯ

Устойчивость разных видов дрожжей к этому фактору заметно варьирует. Большую или меньшую чувствитель­ность дрожжей к концентрации соли оценивают по их спо­собности расти в среде, обеспечивающей хороший рост с 2,5 и 6,5% NaCl. Исследуют устойчивость чистой культу­ры дрожжей из лабораторной коллекции или выделенной из производственного либо природного субстрата.

Для этих целей можно использовать жидкие, полужид­кие и плотные среды.

На жидких средах.

Вариант 1.

Глюкоза.......................................... 2,0 г

Дрожжевой автолизат.................. 0,5 см³

NaCl.............................................. 0–10,0 г

Вода..................................... до 100,0 см³

 

Вариант 2.

Глюкоза.......................................... 2,0 г

Дрожжевой экстракт ...................... 0,5 г

Пептон............................................. 1,0г

NaCl........................................... 0–10,0 г

Вода..................................... до 100,0 см³

Среду разливают в пробирки и стерилизуют при 0,1 МПа. Через 6–10 суток после посева по помутнению среды или образованию осадка регистрируют рост микро­организмов и его интенсивность или отсутствие роста и делают заклю­чение о чувствительности изучаемого микроорганизма к концентрации хлористого натрия.

Концентрация соли, при которой еще регистрируется рост исследуемой культуры дрожжей, принимается за по­казатель ее галотолерантности.

На жидких средах с использованием поплавков.^*** Приготовленные соле­содер­жащие среды разливают по пробиркам на 1/2–2/3 объема, в которые для определения газообразования опускают поплавки. Горлышко пробир­ки закрывают большим пальцем и, осторожно перевора­чивая, заполняют поплавок жидкой средой. Пробирки за­крывают ватно-марлевыми пробками и автоклавируют 20 мин при 0,1 МПа. После автоклави­рования среда из поплавков вытесняется, но по мере охлаждения поплав­ки вновь заполнятся.

Посев производят культурами с сусло-агара или 0,5–1,0 см³ суспензии клеток исследуемых дрожжей.

При необходимости соблюдения анаэробных условий инкубирования после посева поверхность среды заливают стерильным парафином, стерильным вазелиновым маслом или их стерильной смесью 1:1.

Инкубация длится от 24 ч до 10 суток.

О способности исследуемой культуры дрожжей рас­ти при данной концентрации соли свидетельствует га­зообразование и вытеснение питательной среды из по­плавка.

Концентрация соли, при которой еще регистрируется рост исследуемой культуры дрожжей, принимается за по­казатель ее галотолерантности.

На полужидких средах.^*** В жидкие фоновые среды (варианты 1 и 2) вносят 0,5% агара, кипятят до полного его растворения, разливают в пробирки на 1/2 объема, ав­токлавируют 20 мин при 0,1 МПа. Из автоклава пробир­ки переносят в штатив и выдер­живают вертикально до полного охлаждения.

Посев производят бактериологической иглой уколом до дна пробирки культурами с сусло-агара или суспензии клеток исследуемых дрожжей.

При необходимости соблюдения анаэробных условий инкубирования после посева поверхность среды заливают стерильным парафином, стерильным вазелиновым маслом или их стерильной смесью 1:1.

Инкубация длится от 24 ч до 10 суток.

О способности исследуемой культуры дрожжей расти при данной концентрации соли свидетельствует газообра­зование и разрывы столбика полужидкого агара.

Концентрация соли, при которой еще регистрируется рост исследуемой культуры дрожжей, принимается за по­казатель ее галотолерантности.

На плотных средах. В жидкие фоновые среды (вари­анты 1 и 2) вносят 2,5% агара, кипятят до полного его растворения, переливают в коническую колбу на 1/2 объ­ема, закрывают ватно-марлевой пробкой и автоклавируют 20 мин при 0,1 МПа. Сразу после автоклавирования разливают в заранее приготовленные стерильные высу­шенные чашки Петри. Когда агар полностью застынет, чашки необходимо подсушить.

Посев производят бактериологической петлей или шпа­телем Дригальского культурами с сусло-агара или суспен­зии клеток исследуемых дрожжей.

Объем инокулята должен предполагать обязательное получение изолированных колоний после инкубации, что позволит не только выявить наличие или отсутствие рос­та при определенной концентрации соли, но и определить возможное влияние на культуральные свойства, т. е. на состояние клеточной массы.^***

Инкубация длится от 24 ч до 10 суток.

При учете результатов регистрируют наличие или от­сутствие роста дрожжей, его интенсивность и возможные отклонения в структуре колоний от таковых на контроль­ной среде.

Концентрация соли, при которой еще регистрируется рост исследуемой культуры дрожжей, принимается за по­казатель ее галотолерантности.

По разнице в подъемной силе. На технических весах берут две навески испытуемых дрожжей по 0,31 г каж­дая. К первой навеске добавляют 4,8 см³ водопроводной воды, нагретой до 35°С, тщательно размешивают с помо­щью шпателя или пестика в фарфоровой чашке или в ступ­ке, добавляют муку 85%-ного помола от 6,5 до 7,5 г (в за­висимости от ее влажности) и быстро замешивают тесто, придавая ему форму шарика, не прилипающего к рукам.

Таблица 16

Технологические параметры осмотической устойчивости хлебопекарных дрожжей

Шарик опускают в стакан или цилиндр с водой при тем­пературе 32°С, засекают время и поддерживают эту тем­пературу до всплывания шарика.

Ко второй навеске добавляют 4,8 см³ 3,35%-ного рас­твора поваренной соли, нагревают до 35°С и далее посту­пают так же, как с первой навеской.

Время, затраченное на всплывание шариков (мин), умножают на коэффициент 3,5 и получают величину подъ­емной силы, определяемую стандартным способом.

Шарик, замешенный на воде без соли, всплывает бы­стрее. Разница в подъемной силе дрожжей в зависимости от осмотического давления среды, выраженная в мину­тах, характеризует осмоустойчивость, которую рассмат­ривают как косвенный показатель стойкости дрожжей.

Дрожжи с осмоустойчивостью в пределах 10–15 мин стойки при хранении и вполне пригодны для сушки.

Для прессованных хлебопекарных дрожжей в зависи­мости от их осмотической устой­чивости приняты показа­тели качества, указанные в таблице 16.

 

12.7.2. ОТНОШЕНИЕ К КОНЦЕНТРАЦИИ ГЛЮКОЗЫ

Стандартный метод. Готовят среду следующего состава.

Глюкоза...................................................... 50 (60) г

Дрожжевая вода
(или 1% -ный раствор
дрожжевого автолизата)...................... 50 (40) см³

Агар................................................................... 2,5 г

Среду кипятят до полного растворения агара, автоклавируют 15 мин при 112°С и разливают по чашкам.

Посев на чашки производят бактериологической пет­лей или шпателем Дригальского культурами с сусло-ага­ра или суспензии клеток исследуемых дрожжей.

Объем инокулята должен предполагать обязательное получение изолированных колоний после инкубации, что позволит не только выявить наличие или отсутствие рос­та при определенной концентрации глюкозы, но и опре­делить возможное влияние на характер колоний, т. е. на состояние клеточной массы.^***

Инкубация длится от 24 ч до 10 суток.

Концентрация глюкозы, при которой еще регистриру­ется рост исследуемой культуры дрожжей, принимается за показатель ее осмотической устойчивости.

Основным недостатком метода можно считать обиль­ное вытеснение сиропа на поверхность застывшего агара при высоких концентрациях сахара. Это исключает воз­можность получения изолированных колоний и их харак­теристики.^***

В полужидком глюкозно-дрожжевом агаре.^*** Пита­тельная среда включает следую­щие ингредиенты.

Глюкоза...................................... 40–70 г

Дрожжевой автолизат.................. 0,5 см³

Агар................................................ 0,5 г

Вода..................................... до 100,0 см³

Среду кипятят на медленном огне до полного раство­рения агара, разливают в пробирки высоким столбиком и стерилизуют при 0,1 МПа в течение 20 мин.

Полученный таким образом полужидкий агар засты­вает однородной массой, и независимо от концентрации глюкозы на поверхности среды нет капель вытесненного сиропа.

Посев исследуемой культуры производят бактериоло­гической иглой глубоким уколом до дна пробирки.

При необходимости соблюдения анаэробных условий инкубирования после посева поверхность среды заливают стерильным парафином, стерильным вазелиновым маслом или их стерильной смесью 1:1.

Инокулированные среды инкубируют при 30°С в тече­ние 7 дней.

Наличие роста регистрируют по образованию пузырьков газа и разрывам питательной среды по всей длине укола.

При учете результатов отмечают наибольшую концен­трацию глюкозы, при которой еще регистрируется рост, и принимают ее за показатель осмотической устойчивости исследуемой культуры дрожжей.

 

12.8. ОТНОШЕНИЕ К ТЕМПЕРАТУРЕ

12.8.1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОПТИМАЛЬНОЙ ТЕМПЕРАТУРЫ ДЛЯ РОСТА

В последние годы способность дрожжей к рос­ту при определенных температурах все чаще вводят в ключи в качестве дифференцирующего признака. Подав­ляющее большин­ство дрожжей, имеющих технологиче­ское значение, относится к мезофилам. Однако опти­маль­ная температура для роста микроорганизмов этой группы имеет достаточно широкий диапазон. Поэтому необходи­мо определить температуру, обеспечивающую физиоло­гически сбалансированный рост изучаемой культуры. Для этого штрихом бактерио­логической петлей или сплошным посевом шпателем Дригальского засевают в двух повто­рениях плотные питательные среды в чашках Петри или скошенные в пробирках. Посевы помещают в термостат с температурой 15, 20, 25, 30, 35, 40, 43, 45 и 48°С. Для низовых пивных дрожжей температурный интервал сле­дует устанавливать в пределах технологических требо­ваний.

В зависимости от скорости роста через 3–5–7 суток от­мечают интенсивность роста исследуемого организма ви­зуально по 4-балльной шкале: «0» – отсутствие роста, «+» – слабый рост, «++» – хороший рост, «+++» – очень хороший рост.

После первого пассажа проводят второй пассаж, с той лишь разницей, что для каждой температуры посевным материалом служат клетки соответствующего предыдуще­го пассажа. Чашки вновь помещают в термостаты с раз­личной температурой и через 3–5–7 суток отмечают рост и его интенсивность. Количество пассажей определяется исследователем, но, как правило, проводят три пассажа. Температура, при которой исследуемая культура дает оди­наково интенсивный рост (без изменения культуральных признаков^***) в как минимум трех пассажах считается оптимальной.

Таблица 17

Интенсивность роста исследуемых дрожжей в зависимости от температуры

Для записи результатов наблюдений можно использо­вать таблицу 17.

На основании полученных результатов делают вы­вод об оптимальной температуре для роста изучаемой культуры.

При определении температуры, оптимальной для рос­та представителей психрофилов или термофилов, исполь­зуют другие диапазоны температур: соответственно от –5 до 20° и от 50 до 80°С.

 

12.8.2. ХОЛОДО-  И ТЕРМОУСТОЙЧИВОСТЬ ДРОЖЖЕЙ

Брожение сусла при температурах ниже 10°С и выше 30°С часто заканчивается недо­бродом, т. е. неполным сбра­живанием сахаров сусла. Для сбраживания сусла при низ­ких и высоких температурах целесообразно применять холодо- и термоустойчивые расы дрожжей.

Для отбора холодоустойчивых культур изучают бро­дильную способность (скорость и полноту сбраживания 18–20% сахаров в сусле) при температуре 7–10°С и отбирают те расы, которые начинают размножаться и сбраживают сусло быстрее и полнее других. При температуре 30–35°С этими дрожжами сбраживается лишь около 50% сахаров.

Для отбора термоустойчивых культур изучают бро­дильную способность при темпе­ратуре 30–35°С и отбира­ют те расы дрожжей, которые начинают размножаться и сбра–живать сусло быстрее и полнее других при этой тем­пературе.

Методика постановки опытов и контроль за ходом бро­жения описаны в п. 13.2.

Для получения более объективной информации сле­дует использовать микро­скопические методы оценки ка­чественных и количественных параметров состояния ис­следуемых культур дрожжей.^***

Кроме того, важным показателем физиологического состояния исследуемой культуры и возможности ее тех­нологического использования могут служить образующие­ся в данных температурных условиях продукты брожения и степень отличия их количества от таковых при оптималь­ном температурном режиме. Для этого можно использо­вать формулу

5Я + 2У + Б + 2А + Э = Σ £ Г,

описанную в п. 12.5.^***

Целесообразно при отборе новых холодо- и термовы­носливых рас дрожжей в качестве контроля брать музей­ные расы, обладающие этими свойствами.

 

12.9. СПИРТООБРАЗУЮЩАЯ СПОСОБНОСТЬ. КРИВЫЕ БРОЖЕНИЯ

Спиртообразующую способность оценивают по максимальному количеству спирта, которое могут обра­зовать расы при сбраживании высокосахаристого сусла.

Результат учитывается по максимальной спиртуозности бражки, полученной при исполь­зовании исследуемых дрожжей в сусле с достаточным содержанием сахара. Опы­ты проводятся в небольших склянках для брожения вме­стимостью 90 см³, содержащих 60 см³ сусла. В одной се­рии склянок ведут анаэробное брожение под стеклянной трубкой с оттянутым тонким концом, в другой – они за­крыты простыми ватными пробками. Склянки оставляют на брожение в термостате при 25°С. Повторные взвешива­ния позво­ляют начертить кривые потерь массы.

По окончании брожения определяют содержание спир­та пикнометрическим методом, флотационным методом или окислением спирта бихроматом.

 

12.10. СПИРТОУСТОЙЧИВОСТЬ

Известно, что этиловый спирт действует ток­сично на все дрожжевые расы, но его ингибирующая кон­центрация варьирует в широком диапазоне. Присутствие в сусле незначительных количеств спирта оказывает сла­бое стимулирующее действие на размно­жение клеток. Но с увеличением концентрации спирта до 1,5–2,0% размно­жение клеток тормозится, а при 5,0% прекращается пол­ностью. Токсические свойства этого соединения есть ре­зультат нарушения пористости и проницаемости клеточ­ной мембраны, что, естес­твенно, приводит к проблемам транспорта питательных веществ и дефициту доступной цитоплазме воды.

Сложность механизмов устойчивости дрожжевых кле­ток к этиловому спирту подтверждается и тем фактом, что выявлено более 250 генов, участвующих в этом процессе.

 

12.10.1. СТАНДАРТНЫЙ МЕТОД

В большинстве случаев расы, обладающие высокой спиртообразующей способностью, являются и спиртоустойчивыми. Под спиртоустойчивостью следует пони­мать способ­ность рас проявлять жизнедеятельность при высоких концентрациях спирта в среде.

Для определения спиртоустойчивости рас дрожжей готовят разводки исследуемых рас на стерильной среде, содержащей 10–11% спирта и 2% глюкозы при темпера­туре 25°С. Через 5 суток разводку каждой расы дрожжей вносят в количестве 1% в пропасте­ризованную или автоклавированную среду, содержащую 15% спирта и 2% глю­козы. Посев выдерживают при температуре 25°С и отме­чают, на какие сутки в среде дрожжи размножились и начали бродить. О положительном результате свидетельст­вуют помут­нение среды и газообразование.

Наиболее спиртоустойчивыми являются расы дрож­жей, ранее других размножившиеся и забродившие в сре­де с 15% спирта, наименее спиртоустойчивые расы в та­кой среде не размножаются и не бродят.

Опыты удобно ставить в пенициллиновых флаконах, закрытых резиновыми пробками.

 

12.10.2. МЕТОД СЕРИЙНЫХ РАЗВЕДЕНИЙ^***

Инкубирование чистой культуры исследуемой расы дрожжей проводится в приборе, представляющем собой стеклянную бутылку с герметично закрывающейся трех­ходовой крышкой, исключающей испарение спирта при брожении. В сосуд наливается жидкая питательная сре­да и помещается стеклянный поплавок для последую­щей регистрации газообразования. Поплавок заполня­ется жидкой средой, прибор закрывается пробкой через марлевую салфетку и автоклавируется при 0,1 МПа в течение 20 мин.

В качестве субстрата используется глюкозно-дрожжевая среда, содержащая 5% глюкозы и 0,3% дрожжевого автолизата.

Далее в остывшую до комнатной температуры среду внести суточную сусло-культуру исследуемых дрожжей и этиловый спирт. Количество спирта должно соответство­вать серии разведений от 10,0 до 14,0% и более (при необ­ходимости) с шагом 0,5%. В контрольную пробу спирт не вносить.

Жидкая питательная среда, дрожжевая взвесь и эти­ловый спирт дозируются точно в соответствии с произве­денными расчетами заданной концентрации спирта.

После составления питательной среды бутылки плот­но закрыть и для исключения ошибки дополнительно по­крыть резиновыми колпачками.

Инокулированные дрожжевой взвесью спиртосодер­жащие среды поместить в термостат при 30°С и инкубиро­вать в течение 72 ч, регистрируя результаты каждые 24 ч.

Результаты брожения учитывать по четырехкрестной системе, регистрируя объем жидкости, вытесненной из поплавка углекислым газом.

Показателем спиртоустойчивости считать наиболь­шую концентрацию спирта, при которой еще регистриру­ются признаки брожения.

Для подтверждения результатов бродильной пробы по истечении 72 ч инкубации производятся посевы на сусло-агар из образцов с минимальным отрицательным резуль­татом и выше.

Высокие концентрации этилового спирта в среде могут оказывать на дрожжевую клетку микостатическое действие, приводящее к остановке метаболических реакций брожения, но не к гибели клетки. Микоцидные концентрации этило­вого спирта превы­шают концентрации микостатические.

Правило креста. Правило смешивания растворов для получения заданной концен­трации. Для получения рас­твора заданной концентрации из двух растворов пользу­ются следующей схемой:

A₁ = C – C₂

A₂ = C₁ – C

 

где С – необходимая концентрация смеси, С₁ – концентра­ция раствора и A₁ – весовые количества раствора более вы­сокой концентрации, С₂ – концентрация раствора и A₂ – весовое количество раствора более низкой концентрации.

П р и м е р. Из спирта крепостью 80% необходимо по­лучить 50%-ный спирт. Как видно из схемы, для этого к 50 весовым частям 80%-ного спирта прибавляют 30 весо­вых частей воды.

 

12.11. КИСЛОТОУСТОЙЧИВОСТЬ

В годы, неблагоприятные для вызревания ви­нограда, отдельные его партии могут поступать на пере­работку при величине рН сусла 2,5–2,9. Имеются наблю­дения, что не все расы дрожжей могут полностью сбро­дить сахар в сусле с такой низкой кислотностью. Чтобы получить полностью выброженные высококислотные виноматериалы, рекомен­дуется применять кислотоустойчи­вые расы дрожжей.

Кроме того, одним из технологических приемов, пре­дупреждающих инфицирование субстрата посторонней микрофлорой, является подкисление среды органически­ми или неорганическими кислотами. Важным при этом является использование рас, сохраня­ющих свои техноло­гические свойства в кислой среде.

Нижняя граница рН устанавливается в соответствии с отраслевыми и техно­логи­ческими особенностями.

Для отбора кислотоустойчивых культур для виноде­лия необходимо определять их бродильную способность в сусле с величиной рН 2,6 и содержанием сахаров 18% при температуре 25–27°С. При отсутствии в лаборатории сус­ла с такими кондициями его можно получить подкислением 10%-ным раствором винной кислоты и разбавлени­ем водой обычного сусла с более высокой концентрацией сахаров и меньшей кислотностью.

Отбирают те расы дрожжей, которые начинают раз­множаться и сбраживают сусло быстрее и полнее других. В конце брожения необходимо определить остаточные са­хара, чтобы убедиться в полном выбраживании их в сусле с рН 2,6 отобранной культурой.

Методика постановки опытов и контроль за ходом бро­жения описаны в п. 13.2.

Изменив сбраживаемый субстрат, температурный ре­жим инкубации и величину рН, описанный метод можно применить для исследования кислотоустойчивости дрож­жей, используемых в других отраслях промышленности.

Та6лица 18

Предельно допустимые концентрации кислот для пивных дрожжей

Установлено, например, что через 24 ч пивные дрож­жи погибают при концентрациях кислот, указанных в таблице 18.

 

12.12. ФЛОКУЛЯЦИЯ

Большое значение имеет способность дрожжей к оседанию, во многом определяемая их флокуляционной способностью. От этого свойства дрожжей зависят степень сбражи­вания, осветление продукта, редукция диацетила и т. д.

Способность дрожжей к флокуляции определяют по скорости оседания и величине осадка за определенный период.

 

12.12.1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФЛОКУЛЯЦИОННОЙ СПОСОБНОСТИ

Метод ЧССР. Производственные семенные дрожжи, со­держащие 3 г сухого вещества, смывают физиологическим раствором (0,85%-ный раствор поваренной соли) в мерный цилиндр вместимостью 500 см³ и диаметром 5 см и долива­ют до объема 400 см³. После взбалтывания в течение 1 мин цилиндр оставляют в покое и через 12 мин определяют объ­ем осевших дрожжей. Хорошие хлопьевидные дрожжи за это время образуют осадок высотой не менее 28 мм.

Метод Варна. Дрожжи промывают водой и отпрессо­вывают на воронке, затем 5 г их переносят в колбу со 100 см³ дистиллированной воды и перемешивают. Затем 10 см³ сус­пен­зии переносят в градуированную центрифуж­ную пробирку, добавляют 1 см³ уксусно­кислого Na-ацетатного буферного раствора с рН 4,5, встряхивают до по­лучения равно­мерной взвеси и оставляют в покое. Через 10 мин отмечают объем осадка дрожжей. Если объем осадка больше 5 см³, дрожжи хорошо флокулируют, если объ­ем осадка меньше 5 см³, дрожжи флокулируют слабо.

Метод Хельма. Метод состоит в том, что дрожжи про­мывают водой и отпрессо­вывают на воронке, отбирают 1 г и переносят в градуированную центрифужную пробирку вместимостью 15 см³. Затем в эту пробирку добавляют 10 см³ ацетатного буферного раствора, в 1000 см³ которо­го содержится 0,51 г сульфата кальция, 6,8 г ацетата на­трия и 4,05 г ледяной уксусной кислоты при рН 4,5. Дрож­жи при центрифугировании хорошо промывают раство­ром, после чего суспензию выдерживают на водяной бане 20 мин при температуре 20°С. Затем содержимое пробир­ки тщательно взбалтывают до получения равномерной взвеси и оставляют в покое, отмечая величину осадка че­рез равные проме­жутки времени.

Метод позволяет выявить различия между хлопьевид­ными и пылевидными дрожжами.

Суспензия хлопьевидных дрожжей быстро разделя­ется на два слоя и уже через 10 мин образуется осадок, который постепенно уменьшается благодаря уплотнению. У пылевид­ных дрожжей осадок образуется лишь через 30 мин и со временем увеличивается за счет дополнитель­ного оседания взвешенных клеток (рис. 33).

Метод Иошида. Дрожжи из расчета 2–3 млн клеток в 1 см³ вносят в 250 см³ пивного сусла с концентрацией сухих веществ 8% и культивируют 2 суток при 25°С.

Рис. 33

Характер образования осадка у дрожжей:

а – хлопьевидных; б – пылевидных.

Сбраживаемое сусло тщательно перемешивают и по 10 см³ вносят в бутылки диа­метром 6 см, содержащие по 190 см³ стерильного охмеленного сусла. Культивирование про­во­­дят при 11°С. Каждые сутки в бутылках измеряют опти­ческую плотность сбраживаемой жидкости на глубине 3 см от поверхности при λ = 630 нм и видимый или действи­тельный экстракт.

Строят график: по оси ординат откладывают оптиче­скую плотность, а по оси абсцисс – видимый или дейст­вительный экстракт. Полученная кривая характеризует флокуля­ционную способность дрожжей.

С точки зрения технологии следует обратить внима­ние на следующие параметры, характеризующие специ­фику процесса флокуляции:

• интенсивность;
• время наступления;
• скорость образования хлопьев;
• тип хлопьеобразования;
• оптимальные условия среды (температура, состав и т. д.).

По способности флокулировать пивные дрожжи сгруп­пированы в четыре класса:

1. Пылевидные дрожжи. Эти дрожжи диспергирова­ны в бродящем сусле в течение всего брожения. В стацио­нарной фазе они образуют скопления, состоящие из 10 и менее клеток.
2. Флокулирующие дрожжи первого класса. Боль­шую часть периода брожения клетки остаются во взве­шенном состоянии. После сбраживания 2/3 экстракта клетки начинают флокулировать с образованием хлопь­ев, состоящих из 1000 и менее клеток. Осадок дрожжей имеет плотную консистенцию со слегка размытой по­верхностью.
3. Флокулирующие дрожжи второго класса. Процесс флокуляции начинается после сбраживания 2/3 экстрак­та. Хлопья содержат до многих тысяч клеток. Осадок име­ет плотную консистенцию.
4. Флокулирующие дрожжи третьего класса. Процесс флокуляции начинается на ранних стадиях брожения.

Для производства пива низового брожения или лагер­ного пива используют штаммы дрожжей, относящиеся к 1-му и 2-му классу флокулирующих дрожжей. Способность дрожжей к флокуляции определяют любым из вышепере­численных методов. Согласно методу Хельма, хорошо фло­кулирующие дрожжи полностью оседают в растворе аце­татного буфера через 10 мин, в то время как пылевидные дрожжи – через 60 мин. При использовании метода, пред­ложенного чешскими специалистами, дрожжи, имеющие высокую флокуляционную способность, образуют осадок высотой 25–36 мм в стандарт­ном объеме физиологическо­го раствора в течение 12 мин.

 

12.13. ОБРАЗОВАНИЕ МИЦЕЛИЯ

Образование мицелия и псевдомицелия изуча­ют на кукурузном или картофельно-глюкозном агаре ме­тодом пластинок, или культур на стекле (slide-culture).

Кукурузный агар. 12,5 г кукурузной муки в 300 см³ водопроводной воды нагревают на водяной бане при 60°С в течение 1 ч, затем фильтруют через бумажный фильтр. Объем фильтрата доводят до 300 см³, добавляют 3,8 г ага­ра и автоклавируют 15 мин при 121°С. Горячую среду еще раз фильтруют через вату, разливают по пробиркам и сно­ва стерилизуют при том же режиме.

Картофельно-глюкозный агар. 100 г промытого, очи­щенного и измельченного картофеля вымывают в 300 см³ водопроводной воды в течение нескольких часов на холо­де. Массу фильтруют через ткань и автоклавируют в тече­ние 1 ч при 121°С. Для приго­товления агаровой среды к 230 см³ этой жидкости добавляют 770 см³ водопроводной воды, 20 г глюкозы и 20 г агара и стерилизуют в автокла­ве 15 мин при 112°С.

Приготовление препаратов. Расплавленную среду на­ливают в чашки Петри и в нее, зажав пинцетом, опускают и быстро вынимают стерильные предметные стекла. По­крытые пленкой агара стекла помещают на U-образную стеклянную подставку в другой чашке Петри и оставляют до полного застывания среды.

Посевы делают тонкими штрихами – по три на каж­дой пластинке параллельно короткой стороне стекла или по одному вдоль длинной стороны стекла. Стерильные покровные стекла накладывают на штрихи так, чтобы под ними не было пузырьков воздуха и чтобы часть штриха осталась непокрытой. На дно чашки наливают стериль­ную воду во избежание пересыхания слоя агара на пла­стинке.

Через 6–8 дней инкубации при 25°С стекла вынимают и, предварительно очистив их нижнюю поверхность от ага­ра, помещают на столик микроскопа для наблюдений. На таких препаратах не нарушается естественное расположе­ние клеток псевдомицелия, бластоспор или артроспор.

Образование мицелия и псевдомицелия наблюдают в анаэробных (под покровным стеклом) и в аэробных (вне стекла) условиях.

Так как на практике зачастую бывает трудно отличить ложный мицелий от истинного, особенно в культурах, где есть и почкование, и деление, то следует обращать внима­ние на следующее (рис. 34):

 

Рис. 34

Различия между истинным (а) и ложным (б) мицелием

• граница между клетками истинного мицелия – рез­ко преломляющая свет прямая перегородка; граница ме­жду клетками ложного мицелия представлена их изогну­тыми концами и не отличается по преломлению света от боковых стенок гиф;
• в истинных гифах концевые клетки обычно более длинные, чем предшествующие, а в нитях псевдомице­лия – наоборот;
• у истинного мицелия нет перетяжек в зоне пере­городок, а на псевдомицелии эти перетяжки хорошо за­метны.

12.14. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФЕНОТИПОВ: КИЛЛЕР, НЕЙТРАЛЬНЫЙ, ЧУВСТВИТЕЛЬНЫЙ

При описании различий между расами дрож­жей сообщается о том, что все дрожжи Saccharomyces при­надлежат к одному из трех фенотипов: киллер (К), ней­тральный (N) или чувствительный (S).

Применение рас дрожжей определенных фенотипов (К, N или S) позволяет проконтро­лировать, в какой сте­пени чистая культура, внесенная в нестерильное сусло, способна овладеть средой. Для этого необходимо опреде­лить процентное содержание дрожжей фенотипов K, N, S в спонтанно сбраживаемом сусле (контроль) и в отстоян­ном сусле, забродившем при внесении в него разводки чис­той культуры дрожжей определенного фенотипа.

Техника определения фенотипов K, N, S  состоит в сле­дующем.

В чашки Петри разливают агаризованное (1,5%) ви­ноградное сусло за 2–3 суток до использования, чтобы оно слегка подсохло и затем хорошо впитывало нанесенные на него дрожжевые суспензии.

Высушивать лучше в стерильном боксе под УФ-лампой в течение 3–5 ч, поставив перевернутое дно чашки на ребро ее крышки.^***

При работе на виноградном сусле для предотвращения гидролиза агара его 3%-ный водный раствор стерилизуют отдельно от сусла и смешивают при температуре 60–70°С в равных количествах.

Для лучшей контрастности зон подавления роста чув­ствительных культур в расплав­ленную среду можно до­бавлять перед розливом в чашки Петри стерильный 0,5%-ный водный раствор метиленового синего в количестве 1 см³ на 200 см³ среды.

Отдельную колонию штамма дрожжей, фенотип кото­рого необходимо определить, изолируют иглой с плотной питательной среды и примерно в равном соотношении пе­реносят на внутреннюю стенку пробирки с 0,5 см³ стериль­ной водопроводной воды и уколом на чашку Петри с газо­ном культуры фенотипа S.

На одну чашку можно нанести в определенной после­довательности до 30 уколов исследуемых штаммов.

Стерильно готовят водные суспензии тех же колоний в пробирках с 0,5 см³ водо­про­водной воды и на других чаш­ках Петри с сусло-агаром (без газона штамма фенотипа S). Делают петлей газоны исследуемых штаммов дрож­жей диаметром около 1,5 см. На них в центр наносят уко­лом штамм фенотипа К, предварительно выращенный на сусло-агаре. На одну чашку можно нанести газоны десяти исследуемых штаммов в той же после­довательности, что и на газоне штамма фенотипа S. Через 2 суток инкубации чашек Петри с посевами при температуре 25– 28°С опре­деляют фенотипы штаммов.

Если вокруг колоний образовались зоны на газоне чувствительного штамма, то штаммы идентифицируют­ся как киллеры. Штаммы, на газонах которых киллер образует зоны, являются чувствительными, остальные – нейтральными.

В качестве тестеров (индикаторных культур) можно использовать киллер и чувствительные расы коллекци­онных культур S. vini.