К ним относят метод диффузии в агар и метод серийных разведений (на жидкой и плотной питатель­ных средах).

Для посева используют суточные чистые культуры выделенных микроорганизмов. При отсутствии возмож­ности получения чистой культуры можно использовать дрожжевую взвесь или производственный субстрат, содер­жащие всю микрофлору в исследуемом материале.

При исследовании материала, содержащего дрожже­вые клетки, в остывшие до
45–50°С питательные среды вносят нистатин и тщательно перемешивают.

17.1. МЕТОД ДИФФУЗИИ В АГАР (МЕТОД БУМАЖНЫХ ДИСКОВ)

Наиболее простой в исполнении метод, однако его нельзя считать количественным.

В качестве основы питательной среды целесообразно применять производственное агаризованное (2,5%) сусло с содержанием 120–140 мг% аминного азота. Питатель­ную среду разливают в чашки Петри слоем 4–5 мм. Перед посевом чашки со средой досушивают в термостате или в стерильном боксе.

Диски с антибиотиками (диаметр 5–6 мм) готовят из специальных сортов фильтровальной бумаги. Каждый диск содержит определенное количество антибиотика, которое указано на этикетке флакона. Во флакон насыпа­ют силикагель, который впитывает влагу и служит индикатором: при переувлажнении силикагель меняет окра­ску с синей на розовую. При изменении окраски силикагеля во флаконе диски для исполь­зования не пригодны. Флаконы с дисками хранят при температуре 4–20°С.

0,5 см³ исследуемого материала наносят на агар и шпа­телем Дригальского тщательно распределяют по поверх­ности питательной среды до полного впитывания. Затем на поверх­ность среды стерильным пинцетом накладыва­ют, плотно прижимая, диски с разными антибиотиками на расстоянии 2–2,5 см друг от друга и от края чашки. Чашки с дисками выдерживают в термостате при 37°С в течение 24–48 ч в положении вверх дном.

Антибиотик из диска диффундирует в агар, вызывая гибель чувствительных бактерий, формируя таким обра­зом вокруг диска зону отсутствия роста. Ближе к диску концен­трация антибиотика в агаре выше, по мере удале­ния от диска концентрация снижается. Следовательно, чем больше диаметр зоны задержки роста вокруг антибиотика, тем более чувствительна к нему исследуемая культура.

Диаметр зоны задержки (отсутствия) роста микроорга­низмов измеряют с помощью линейки или миллиметровой бумаги с точностью до 1 мм. Отсутствие зоны задержки рос­та микроорганизмов вокруг диска указывает на устойчи­вость исследуемой культуры к данному антибиотику.

При зоне отсутствия роста до 10 мм культура счита­ется устойчивой, от 10 до 15 мм говорят о малой чувстви­тельности к антибиотику, от 15 до 25 мм – о достаточ­ной чувствительности, свыше 25 мм – о высокой чувст­вительности.

17.2. МЕТОД СЕРИЙНЫХ РАЗВЕДЕНИЙ

Для проведения опыта готовят основные рас­творы антибиотиков. Готовятся они с та­ким расчетом, что­бы в первой пробирке концентрация антибиотика соста­вила 100 ЕД/см³.

На этикетке ампулы или флакона указана концентра­ция антибиотика в ЕД/см³ или мкг/см³. Навески бензил-пенициллина калиевой или натриевой соли, ампициллина три­гид­рата, оксациллина натриевой соли, цефалотина, цефалексина растворяют в 1/15 М фосфатном буфере (ка­лия фосфат однозамещенный – 3,63 г, натрия фосфат двузаме­щенный – 7,13 г, вода дистиллированная – до 1000 см3). Основные растворы тетрацик­линовых антибио­тиков готовят на 0,01 Н растворе соляной кислоты. Для приготовления основных растворов нео-, моно-, канамицина используют дистиллированную воду.

Если на этикетке препарата дозировка указана в весо­вых единицах, следует иметь в виду, что для большей час­ти антибиотиков 1 г активного вещества соответствует 1 000 000 ЕД. Из этого расчета и следует разводить анти­биотик.

Если порошок антибиотика, расфасован немерно и на этикетке указано количество единиц активности в 1 мг, необходимо к точной навеске препарата, сделанной на аналитических весах, добавить равный объем раствори­теля, т. е. получить раствор мг/см³, в 1 см³ которого со­держится столько единиц, сколько их было указано на этикетке. Из этого основного раствора делают дальней­шие разведения.

Для определения чувствительности микробов к суль­фаниламидам может быть применен любой из указанных методов, причем во внимание принимается только степень разведения навески препарата.

17.2.1. МЕТОД СЕРИЙНЫХ РАЗВЕДЕНИЙ В ЖИДКОЙ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЕ

На основе стерильного производственного сусла гото­вится серия 2-кратных серийных разведений исследуемо­го антибиотика. Первая пробирка содержит 100 ЕД/см³ антибиотика, каждая последующая – в два раза мень­ше. Засевная доза исследуемой суточной бактериальной культуры составляет 10% от общего объема питательной среды.

Питательную среду разливают по 4,5 см³ в пробирки, расставленные в штативы по 10 в каждом ряду. Готовят основной раствор антибиотика и добавляют 4,5 см³ этого раствора в первую пробирку. После тщательного перемешивания новой стерильной мерной пипеткой переносят 4,5 см³ из этой пробирки в следующую и т. д. до девятой пробирки, из которой 4,5 см³ выливают. Десятая пробир­ка, не содержащая антибиотика, служит контролем роста культуры.

Для постановки этого опыта используют имеющиеся в продаже препараты, на этикетке которых указано количе­ство единиц во флаконе. Например, если флакон содержит 500  000 ЕД пенициллина, то, добавив в него 10 см³ дистил­лированной воды, получают раствор, содержащий в 1 см³ 50 000 ЕД, при дальнейшем разведении в 100 раз получа­ют раствор с концентрацией пенициллина 500 ЕД/см³. Для получения требуемой концентра­ции антибиотика даль­нейшие разведения целесообразнее делать с использова­нием стерильной питательной среды.

Чистые агаровые или бульонные культуры микроор­ганизмов предварительно разводят физиологическим рас­твором до концентрации клеток 5·10⁶ клеток/см³ в соот­ветствии со стандартом мутности.

Агаровую культуру испытуемого микроба смывают изотоническим раствором хлорида натрия. Полученную взвесь по 1,0 см³ вносят во все пробирки ряда, начиная с контроль­ной.

Результаты регистрируют после инкубации при 37°С в течение 24–48 ч. Последняя пробирка с прозрачным бульоном, при наличии густого роста в контроле, опреде­ляет минимальную, подавляющую рост данного микро­организма концентрацию антибиотика.

Учет результатов: наименьшее количество антибиоти­ка, дающее визуально полную задержку роста (среда про­зрачная), соответствует минимальной подавляющей кон­центрации препарата (МПК или МБсК). Минимальную бактерицидную концентрацию (МБцК) определяют вы­севом на плотные питательные среды из последних про­зрачных пробирок, которые предварительно встряхива­ют. Наименьшее количество антибиотика в пробирке, со­держимое которой после инкубирования в течение 24–72 ч не дало роста бактерий при высеве на питательную среду, принимают за МБцК.

17.2.2. МЕТОД СЕРИЙНЫХ РАЗВЕДЕНИЙ НА ПЛОТНОЙ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЕ

Для определения чувствительности к антибиотикам большинства микроорганизмов используют МПА или 2,5%-ный агар на основе производственного сусла с со­держанием аминного азота 120–140 мг/см³. Приготовлен­ный основной раствор антибиотиков разво­дят в плотной питательной среде. Для этого к расплавленному и охлаж­денному до 55°С агару, разлитому в широкие пробирки по 18 см³, добавляют по 2 см³ соответствующего разведения определенного антибиотика, тщательно перемешивают и переливают в сте­рильную чашку Петри. После застывания агара чашки Петри подсушивают в течение 1 ч. Контроль­ные чашки Петри с агаром не содержат антибиотика. Все чашки Петри делят на сектора, каждый из которых засева­ют исследуемой культурой. Посев делают бакте­риологиче­ской петлей из микробной суспензии с концентрацией кле­ток 10⁶–10⁷ клеток/см³. Чашки помещают в термостат при 37°С на 24–48 ч.

Наименьшую концентрацию антибиотика, при кото­рой наблюдают полную задержку роста бактерий на агаре или рост единичных колоний, принимают за МПК препа­рата. В том случае, когда рост культуры отсутствует на всех чашках, кроме контрольной, считают, что исследуе­мые концентрации антибиотиков превышают МПК пре­парата. Если на всех чашках отмечают рост культуры, это значит, что микроорганизм устойчив ко всем концентра­циям антибиотика.

Общую чувствительность к сульфаниламидам, как и к антибиотикам, можно определить методом канавки. На агаре в чашке Петри по ее диаметру прорезают канавку, в которую вносят определенное разведение изучаемого пре­парата. Перпендикулярно к канавке засевают штрихом изучаемые культуры микроорганизмов. После инкубации при 37°С 24–48 ч отмечают наличие участков задержки роста микроорганизмов, если послед­ние чувствительны к данному препарату.