Морфологические особенности бактерий в связи с их малыми размерами, способностью некоторых из них двигаться удобнее изучать в окрашенных препаратах. Исследование микробов в окрашенном виде дает возможность при правильном приготовлении препаратов получать четкие, контрастные изображения объектов наблюдения.
Для окраски микробов применяют анилиновые краски, преимущественно основные, реже — кислые. Они имеют вид порошков или кристалликов, из которых готовят спиртовые, спиртово-водные и водные растворы красок.
Спиртовые, или насыщенные, растворы красок готовят путем растворения в спирте 10-15% сухой краски (10-15 г краски на 100 мл 96%-ного раствора спирта). Раствор оставляют на несколько дней и за это время несколько раз встряхивают. Жидкую часть краски сливают в склянку и по мере необходимости используют для приготовления спиртово-водных растворов. Последние готовят разведением спиртовых растворов дистиллированной водой. Чтобы усилить красящую способность, к растворам красок добавляют щелочи, фенол, танин и др. Наиболее употребительными растворами красок являются следующие.
Карболовый фуксин. 1 г основного фуксина растирают в ступке с 5 г карболовой кислоты, добавляя порциями 10 мл этилового спирта и 100 мл дистиллированной воды. Раствор в течение 2 сут. отстаивают и фильтруют через фильтровальную бумагу.
Разведенный карболовый фуксин. Готовят карболовый фуксин разведением его дистиллированной водой в соотношении 1:10.
Карболовый генцианвиолет. Готовят аналогично карболовому фуксину.
Водные растворы метиленовой сини, кристаллвиолета, метил-виолета готовят растворением 1 г краски в 300 мл дистиллированной воды.
После приготовления краски фильтруют через фильтровальную бумагу и хранят в темном месте. Для работы краски разливают во флаконы с пипетками или в капельницы с притертыми пробками.
Приготовление окрашенного препарата. Процесс приготовления состоит из приготовления мазка, высушивания, фиксации и окраски.
Готовят мазок следующим образом. На середину чистого предметного стекла, предварительно обезжиренного прокаливанием или любым другим способом, охлажденного до комнатной температуры, помещают каплю воды, бактериологической петлей вносят в нее небольшое количество микроорганизмов и тщательно перемешивают, распределяя культуру тонким слоем на предметном стекле (бактериологическая петля представляет собой нихромовую проволоку, вмонтированную в ручку). Мазок подсушивают в воздухе. Для этого предметное стекло берут за уголки большим и указательным пальцами и медленно проводят его над пламенем горелки или спиртовки 3-4 раза, держа стороной с нанесенным материалом вверх. Длительная фиксация может изменить структуру клеток и их форму; недостаточная фиксация приведет при последующей обработке мазка к его смыванию с поверхности стекла. Фиксация должна обеспечить лучшее закрепление микробных клеток на стекле, убить микроорганизмы (мертвые клетки лучше окрашиваются, чем живые).
Если исследуемые микроорганизмы находятся в жидкой среде, то на предметное стекло наносят каплю микробной суспензии (взвеси) без добавления воды или другой жидкости. Суспензию берут стеклянной палочкой или бактериологической петлей.
Окраску мазка осуществляют следующим образом. На охлажденный фиксированный мазок наносят 2-3 капли красителя. Через 40-60 смывают его слабой струей воды из промывалки, пока вода не станет прозрачной. Промытый мазок высушивают либо на воздухе, либо промокают его фильтровальной бумагой.
На сухой препарат наносят каплю иммерсионного масла и микроскопируют с объективом 90х. При сложных способах окраски применяют два красящих вещества и более.
Окраска бактерий по методу Грама имеет большое значение для распознавания бактерий и отнесения к одной из групп: грамположительным (окрашивающиеся по Граму) или грамотрицательным (не окрашивающиеся по Граму).
Сущность метода заключается в том, что образующиеся при окрашивании клеток сложные соединения красителя с йодом и белками цитоплазмы у грамположительных бактерий удерживаются при последующей обработке препарата спиртом и клетки сохраняются окрашенными, а у грамотрицательных — обесцвечиваются. Здесь, по-видимому, играет роль и неодинаковая проницаемость клеточной оболочки и цитоплазматической мембраны для комплекса «краситель — йод» в связи с различием химического состава и структуры этих оболочек у разных бактерий. Возможно, что различное отношение к окраске по Граму связано с наличием в цитоплазме грамположительных бактерий значительного количества магниевой соли рибонуклеиновой кислоты, которая образует с генцианвиолетом и йодом нерастворимый в спирте комплекс.
Техника окраски по Граму. Заключается она в следующем. На фиксированный мазок наносят 2-3 капли раствора генциан-виолета и через 2-3 мин окрашивания краску смывают водой. На препарат наносят 2-3 капли раствора Люголя и спустя 2-3 мин смывают водой. Препарат на 30-40 с погружают в стаканчик с 96 %-ным раствором спирта и быстро промывают водой. Затем препарат в течение 1-2 мин докрашивают разведенным фуксином, промывают водой и просушивают фильтровальной бумагой. Грамположительные бактерии будут фиолетовыми, грамотрицательные — красными, так как обесцвеченные спиртом, они воспринимают дополнительную окраску фуксином.
При окрашивании мазка по Граму следует обратить внимание на процесс обесцвечивания мазка спиртом. При недостаточной обработке все клетки сохраняют окраску, при избыточной — обесцвечиваются. Для контроля окраски на одном предметном стекле следует сделать три мазка бактерий: один — заведомо грамположительных бактерий, другой — заведомо грамотрицательных, третий — исследуемых микроорганизмов. Микроскопируют препарат с объективом 90х.
В процессе занятий учащимся необходимо промикроскопировать несколько заранее приготовленных окрашенных препаратов, например стафилококков, сарцин, палочковидных бесспоровых и споровых бактерий и др.; обратить внимание на форму клеток, характер их взаимного расположения, наличие и местоположение спор; выполнить зарисовки; освоить технику микроскопирования.
