Самая распространенная причина снижения активности микрофлоры заквасок - это воздействие бактериофагов. Поражение молочнокислых бактерий фагами является одной из самых трудноустранимых причин снижения активности заквасок при производстве ферментированных видов молочной продукции.

Бактериофаги - это вирусы бактерий, вызывающие лизис клеток бактерий. Циклы и этапы развития бактериофага показаны на рисунке 3.4.

Рис. 3.4
Циклы и этапы развития бактериофага:
1 - бактериальная клетка;  2 - прикрепление фага к клетке;  3 - впрыскивание ДНК фага в клетку;
4 - репликация ДНК фага; 5 - синтез структурных элементов фага; 6 - сборка бактериофагов;
7-лизис клетки; 8 - встраивание ДНК фага в хромосому клетки; 9, 10 - размножение лизогенных клеток.

Фаговая частица адсорбируется на клетке бактерии, лизирует в месте адсорбции клеточную стенку и впрыскивает свою ДНК, после чего она начинает реплицироваться и перестраивает работу клетки-хозяина так, что она начинает синтезировать белки, необходимые фагу. Из этих компонентов происходит сборка фаговых частиц (от М до 300), которые разрушают клетку и выходят наружу, поражая новые клетки. Такой цикл развития вирусов называется литическим и занимает 30-60 мин.

Если фаг присутствует в форме профага, то он находится (способен встраиваться) в геноме клетки и передается по наследству другим клеткам, но в неблагоприятных условиях становится зрелым (вирулентным), т. е. способным поражать (лидировать) клетки. Такой цикл развития фагов и зараженные клетки называются лизогенными. Фаги являются специфичными, т. е. поражают определенные виды или даже штаммы. По оценкам зарубежных специалистов, 5- 15% случаев нарушений технологических процессов при производстве кисломолочных продуктов объясняются действием бактериофагов. По данным наших ученых» наличие бактериофагов обнаружено в 76 случаях из 100 при задержке сквашивания молока. Причиной этого является высокая скорость размножения бактериофагов при благоприятных условиях (большое обсеменение сырья, наличие в молоке посторонних веществ, уровень чувствительности к конкретному фагу клеток заквасочной микрофлоры, неудовлетворительное санитарно- гигиеническое состояние производства). Количество бактериофага в молоке через % ч может увеличиться на 3-5 порядков, при этом количество молочнокислых бактерий за то же время примерно в 16 раз.

Бактериофаги отличаются размерами частиц, головки и хвостового отростка, а также формой головки. Морфологические и морфометрические признаки фаговых частиц, а также ДНК/ДНК гомология являются основополагающими при их классификации. Из литературы известно, что геном бактериофагов представляет двойную ДНК молекулу размером 18-55 тыс. пар нуклеотидов.

Фаги, лизирующие молочнокислые бактерии, имеют различную структуру (рис. 3.5) и относятся к следующим группам (в соответствии с классификацией Д. Е. Бредли и Н. W. Ackermann):

• морфотип А - фаги имеют сокращающийся хвостовой отросток;
• морфотип В1 - фаги с изометрической (шестигранной) головкой (диаметр - 46-70 нм) и длинным хвостовым отростком (длина - 95-270 нм, толщина- 6,5-12,5 нм);
• морфотип В2 - фаги с вытянутыми овальными головками (диаметр - 33-63 нм), более короткими и тонкими хвостовыми отростками (длина - 78- 100 нм, толщина - 5-8 нм);
• морфотип С - фаги с изометрической головкой и очень коротким хвостовым отростком.

По литическому действию на молочнокислые бактерии фаги делят на:

• лактококкофаги - бактериофаги, лизирующие клетки лактококков;
• термострептококкофаги- бактериофаги, лизирующие клетки термофильных молочнокислых стрептококков;
• мезолактобациллофаги - бактериофаги, лизирующие клетки мезо- фильных молочнокислых палочек;
• термолактобациллофаги - бактериофаги, лизирующие клетки термофильных молочнокислых палочек.

Рис. 3.5
Морфология бактериофагов молочнокислых бактерий

Наиболее чувствительными к бактериофагам являются мезофильные лактококки; термофильные стрептококки и молочнокислые палочки подвержены бактериофагии в меньшей степени. Бактериофаги, лизирующие молочнокислые кокки, по структуре бывают чаще всего двух типов – В1 или В2. Фаги, лизирующие термофильные молочнокислые стрептококки, имеют маленькую головку (45-60 нм) и очень длинный хвостовой отросток (130-960 нм) толщиной 8-9 нм. Фаги, лизирующие лактобациллы L. plantarum и L, helveticus, были отнесены к группе А. Фаги, лизирующие лактобациллы L. delbrueckii (ssp. bulga- ricus и ssp. lactis), относят к группам А или С. Обычно это монофаги, но наблюдается тенденция к расширению спектра литического действия, т. е. к полифагии.

Источники бактериофагов на молочных предприятиях условно можно разделить на:

• прямые источники - источники, в которых содержатся клетки бактерий и поэтому фаги в них могут размножаться;
• косвенные источники - источники, в которых фаги содержатся и могут ими переноситься; в косвенных источниках, как правило, фаги не размножаются.

К прямым источникам относят:

• лизогенные культуры, входящие в состав заквасок (неконцентрированные и концентрированные - закваски прямого внесения);
• сырое и сухое молоко, сливки;
• пастеризованные молоко и сливки, нормализованную смесь;
• производственную закваску;
• заквашенную смесь;
• готовый продукт; сыворотку.

К косвенным источникам относят:

• оборудование и инвентарь;
• воздух;
• производственные цеха и участки (стены, полы, потолки и др.);
• солильные бассейны;
• санитарную одежду сотрудников;
• сотрудников предприятий.

Косвенные показатели фаголизиса:

• увеличение продолжительности свертывания молока;
• низкая титруемая кислотность после сквашивания;
• невыраженный вкус закваски или продукта (из-за лизиса гетерофер- ментативных кокков й снижения ароматообразования);
• проблемы текстуры.

Благоприятные условия для размножения фагов: температура 8-36°С, кислая реакция среды, добавление хлорида кальция, разбрызгивание сыворотки, перемешивание; непрерывное ведение технологического процесса. Бактериофаги выдерживают режимы пастеризации, а некоторые - ультрапастеризацию; устойчивы к кислой и щелочной реакции среды в интервале 0,5-12,0 ед. рН; хорошо переносят замораживание и длительное хранение в сухих продуктах. Внесение сычужного фермента, обработка оборудования и воздуха дезинфицируюхцими веществами, УФ-лучами приводят к снижению количества фагов, но не к полному их уничтожению. При хранении на рассеянном свету при комнатной температуре в прозрачной среде полное отмирание бактериофагов, способных лизировать молочнокислые бактерии, наступает только через 5 дней. В молоке, в силу его непрозрачности, свет не оказывает действия на бактериофаги.

К наиболее эффективно действующим средствам на бактериофаги молочнокислых бактерий относят дезинфицирующие средства, состоящие из пероксида водорода, надуксусной и уксусной кислот.

Полностью исключить контакты заквасочной микрофлоры с бактериофагами в производственных условиях невозможно, так как ферментированные молочные продукты вырабатываются из нестерильного сырья в контакте с нестерильной внешней средой. Следует систематически проводить работу по профилактике поражения микрофлоры заквасок бактериофагами.

Для выявления бактериофагов в различных источниках применяют косвенные и прямые методы.

К косвенным признакам наличия бактериофагов относятся следующие:

• низкая титруемая кислотность в конечный период сквашивания заквасок или продукта;
• увеличение продолжительности свертывания нормализованной смеси;
• невыраженный вкус закваски или продукта (снижение газо- и аромато- образования);
• торможение или отсутствие нарастания кислотности сыворотки при получении и обработке зерна;
• обнаружение агглютинации и измененных форм клеток в микроскопическом препарате.

Прямые методы выявления бактериофагов могут быть выполнены:

путем посева исследуемого образца в стерильное обезжиренное молоко с метиленовым голубым; если в процессе культивирования после обесцвечивания индикатора через 3-5 ч снова наблюдается посинение молока, это указывает на наличие бактериофага;

путем нанесения образцов в виде капель на чашку Петри с агаризованной питательной средой (гиролизованное молоко с агаром ATM, среда Ml7 или другие), на которую предварительно нанесена чувствительная культура в фазе логарифмического роста с последующим культивированием при оптимальной температуре развития чувствительной культуры. В случае появления прозрачных зон лизиса считают, что в образце бактериофаги присутствуют.

Все новые заквасочные культуры проверяются на фагоустойчивость (посев на ATM газоном, внесение микрокапель фильтрата с известными бактериофагами, по отсутствию роста колоний устанавливают фагочувствительность). Фагорезистентность бактерий контролируется как основной ДНК, так и плазмидами.

Способы борьбы с бактериофагами:

• асептическое культивирование заквасок;
• использование многовидовых многоштаммовых заквасок с постоянной ротацией (заменой);
• применение заквасок прямого внесения;
• создание фагорезистентных культур и заквасок с использованием методов генной инженерии;
• соблюдение правил санитарии и гигиены, особенно мойки и дезинфекции оборудования и воздуха.

Необходимым элементом управления фаговой ситуацией в молочной промышленности является регулярный контроль обсемененности предприятий бактериофагами - фаговый мониторинг. Мониторинг бактериофагов - выявление качественного и количественного состава фагов по ходу технологических процессов и в течение сезонов года. Титр бактериофагов - количество частиц фагов в 1 см³ исследуемой пробы.

Фаговый мониторинг осуществляется на нескольких уровнях:

• ежедневный контроль активности производственной закваски;
• ежедневный контроль активности молочнокислого брожения в процессе выработки продукции;
• периодическое Определение титра фагов в различных объектах, особенно в закваске, сыворотке, воздухе (по количеству негативных колоний на газонах индикаторных культур).

Особое внимание необходимо уделять соблюдению правил приготовления закваски, ротации культур, мойке и дезинфекции оборудования, чистоте воздуха. К новым направлениям предупреждения бактериофагии можно отнести применение антифаговых питательных сред.

На отечественных молочных предприятиях практически не проводится фаговый мониторинг, который позволял бы систематически устанавливать наиболее опасные критические контрольные точки и вовремя разрабатывать и осуществлять профилактические и корректирующие мероприятия. Это связано с недостаточным количеством и подготовкой кадров микробиологической лаборатории, а также дополнительными материальными затратами, хотя при обострении фаговой ситуации потери на предприятии бывают гораздо большими.