В современной пищевой промышленности с хорошо налаженной системой НАССРоценка микробиологического качества пищевых продуктов не ограничивается анализом готового продукта. Она включает оценку микробиологического качества сырья, ингредиентов, санитарно-гигиенических процедур, технологических операций и срока хранения продукта. Вместе с тем развитие международной торговли требует оценки микробиологического качества пищевых продуктов в соответствии с общепринятыми стандартизованными методами и аналитическими параметрами – микробиологическими или химическими. В этом смысле микробиологические индикаторы являются необходимым инструментом контроля производства, оценки качества и регулирования торговли пищевыми продуктами.

12.5.1. Зимологические индикаторы

В тех пищевых продуктах, основной доминирующей микрофлорой в которых являются дрожжи, а патогенные микроорганизмы не развиваются или не выживают, главную микробиологическую проблему составляет присутствие ДВПП. Исключением являются дрожжи, представляющие опасность для определенных групп больных людей [99, 152], а также случаи взрыва бутылок вследствие образования СО2 в результате повторного брожения [204, 216]. Оценка зимологического (от греч. «зимо» – дрожжи) качества продукта направлена на предотвращение риска ухудшения качества готового продукта и выполняется, как правило, посредством чашечного подсчета дрожжевых клеток с использованием обычных культуральных сред. Этот показатель «всех» жизнеспособных дрожжей (более известный как «подсчет дрожжей и плесеней») подобно показателю «общего количества жизнеспособных микроорганизмов», используемому в пищевой бактериологии, позволяет получить довольно ограниченную информацию, явно недостаточную для оценки стабильности пищевого продукта. Более того, этот подсчет сводит воедино определение численности двух групп микроорганизмов, имеющих различную значимость. В большинстве отраслей пищевой промышленности вместо выбора целевых микроорганизмов (или методов их идентификации) по их технологической значимости до сих пор работают по принципу «делай, как принято» [150]. Это ограничение возникает по причине невозможности практического определения численности ДВПП, поскольку среды общего назначения благоприятствуют быстрорастущим дрожжам, а это приводит либо к недооценке наиболее опасных видов дрожжей (медленно растущих), либо к полному подавлению их роста. Такая ситуация не возникает, если ДВПП являются единственными присутствующими в продукте микроорганизмами. Тем не менее этот показатель численности дрожжей очень полезен в ретроспективном отношении для оценки эффективности санитарно-гигиенических операций, поскольку позволяет выявить источники контаминации в технологической цепи. Существуют и другие индикаторы присутствия или активности дрожжей, но, в отличие от бактериальных индикаторов, лишь немногие из них нашли промышленное применение, что свидетельствует о низкой значимости зимологических индикаторов для микробиологов и технологов пищевых производств. Подобные индикаторы можно условно разделить на три категории, которые мы рассмотрим ниже.

12.5.1.1.   Индикаторы, основанные на культивировании клеток

В качестве зимологических индикаторов можно использовать подсчет дрожжей на селективной и/или дифференцирующей среде. Например, определение численности «кислотоустойчивых дрожжей» на среде ZBA [68] или TGYA [131, 132] оказывается особенно полезным для оценки зимологического качества подкисленных пищевых продуктов и напитков. Подсчет «ксеротолерантных/осмофильных дрожжей» на средах общего назначения при добавлении высоких концентраций сахаров [32, 33], глицерина [104] и хлорида натрия [5] может использоваться для анализа фруктовых концентратов, кондитерских изделий и рассолов. Среда ZDM [194] применяется в случае пищевых продуктов, чувствительных к Z. bailii и Z. bisporus. Лизиновый агар применяют для обнаружения видов дрожжей-несахаромицетов [100], которые в некоторых условиях могут использоваться в качестве гигиенического индикатора. Еще одним важным зимологическим индикатором для оценки качества красных вин, выдерживаемых в дубовых бочках, является численность дрожжей, продуцирующих 4-этилфенол, определяемая на среде DBDM [183]. Среда ESA [111] оказалась непригодной для обнаружения S. cerevisiae [100]. В качестве альтернативы для оценки популяции Saccharomyces spp. могут быть использованы сравнительные подсчеты в среде общего назначения, в лизиновой среде [100] или среде общего назначения с 4 ppm (частей на миллион) циклогексимида. Аналогичный подход применяется в бактериологии, где для выявления контаминантов различных пищевых продуктов используют широкий набор бактериальных индикаторов. При идентификации целевых видов результаты, полученные при использовании этих сред, следует рассматривать как предварительные, так как во многих случаях для подтверждения результатов требуется дополнительное тестирование с применением методов идентификации или типирования.

12.5.1.2.   Химические и органолептические индикаторы

Альтернативой зимологическим индикаторам, основанным на микробиологических культурах и требующих больших затрат времени, является анализ образцов пищевых продуктов в целях получения химических (или органолептических) данных о ретроспективной активности микроорганизмов. Использование метаболитов в качестве индикаторов порчи (например, показателем активности уксуснокислых бактерий в винах может являться содержание летучих кислот) зачастую удобнее и быстрее, чем выполнение микробиологических подсчетов. Некоторые из ранее упоминавшихся инструментальных методов измеряют, по сути, изменение химических или физических характеристик. Предполагается, однако, что характеристики, полученные с помощью инструментальных методов, хорошо коррелируют с подсчетами микроорганизмов, что не всегда справедливо при оценке химических маркеров. В качестве средств оценки степени дрожжевой порчи пищевых продуктов получили признание лишь несколько химических соединении. Так, содержание этанола и ацетоина являются соответственно надежными индикаторами качества поступающих на переработку фруктов и санитарно-гигиенического состояния технологического участка [151]. Анализ содержания диоксида углерода в закрытом бюксе с культурой с использованием селективной среды и газохроматографического анализа предложен для ускоренного определения численности бродильных дрожжей [93] и прогнозирования срока хранения [85]. Имеются данные об использовании в качестве индикатора активности осмофильных ДВПП в марципане 1,3-пентадиена [32], а 4-этилфенол может использоваться как органолептический или химический маркер для выявления вин, контаминированных дрожжами родов Dekkera или Brettanomyces[183]. Такие химические маркеры могут считаться «предсказателями порчи», поскольку в малых концентрациях их можно обнаружить еще до начала процесса порчи пищевого продукта. В качестве химического маркера для оценки активности опасных ДВПП (например, P. anomala) при предферментационной мацерации и отстое светлого виноградного сока нельзя использовать этилацетат, так как его образование происходит настолько быстро [168], что сок окажется испорченным раньше, чем будут получены результаты анализа.

12.5.1.3. Индикаторы на основе биомаркеров

Зимологические индикаторы могут также основываться на содержании в ДВПП высокомолекулярных жирных кислот [11, 135, 136, 192]. Обоснование этого подхода дается, например, в работах [127, 130]. Жирнокислотная характеризация видов дрожжей представлена в табл. 12.5. Эти данные имеют важное значение, поскольку показывают, что условия культивирования не оказывают существенного влияния на жирнокислотный состав биомассы, как это было принято считать ранее [53, 177, 213]. Основываясь на наличии или отсутствии полиненасыщенных (C18) жирных кислот, можно разделить присутствующие в пищевых продуктах дрожжи на три большие группы с различной технологической значимостью.

Дрожжи, представляющие наибольшую опасность для некоторых отраслей пищевой промышленности, относятся к группе II – это Dekkera spp. и Zygosaccharomyces spp. – для винодельческой промышленности; Zygosaccharomyces spp. и T. delbrueckii – для отраслей, производящих фруктовые концентраты и соки; Y. lipolytica – для сыроделия; Zygosaccharomyces spp. – для производства майонеза, заправок для салатов и некоторых кондитерских изделий, в частности, марципана. Безвредные виды из этой группы, такие как S. dairensis, встречаются очень редкой имеют четко определенные экологические пиши. При этих условиях группа, обозначенная как [С18:2 (+); C18:3(-)], может рассматриваться как прекрасный зимологический индикатор для всех отраслей пищевой промышленности, в которых опасность представляют дрожжи родов Zygosaccharomyces, Dekkera, Torulaspora и Yarrovia. Дрожжи группы I в определенных ситуациях могут представлять опасность для индустрии соков и фруктовых концентратов, виноделия и производства безалкогольных напитков. К этой группе дрожжей, характеризующейся отсутствием жирных кислот С18:2 и С18:3, относятся виды Saccharomyces spp., род Hanseniaspora spp, не являющийся опасным с точки зрения порчи, и роды Saccharomycodes и Schizosaccharomyces. Два последних могут быть довольно опасными для винодельческой промышленности, но они встречаются крайне редко и их клеточная морфология легкораспознается.

Таблица12.5. Классификация присутствующих в пищевых продуктах видов дрожжей по содержанию полиненасыщенных (С18) жирных кислот. По [127]

В группе III объединено большое количество видов, обладающих некоторыми общими характеристиками (например, одинаковым окислительным метаболизмом). Иногда их объединяют по способности образовывать пленку на поверхности жидкости. В целом с точки зрения порчи пищевых продуктов эти виды не представляют большой опасности. Зачастую их присутствие в пищевых продуктах вызывается несоблюдением на некоторых предприятиях санитарно-гигиенических требований или контактом продуктов с кислородом. В таких случаях (например, в винодельческой и пивоваренной промышленности) группа дрожжей, содержащих С18:2C18:3может рассматриваться как зимологический индикатор нарушения технологии производства. Тем не менее вид I. orientalis может создавать проблемы при производстве майонеза и заправок к салатам, a D. hansenii – при производстве марципана. Так, например, при производстве вяленой свинины и консервированных оливок наибольший интерес из группы III представляют, соответственно, Oyptococcus spp. иD. hansenii, а также P. Membranifaciens и D. hansenii, но с точки зрения порчи эти виды не считают особо опасными.

Вышеупомянутые «грубое» разделение видов дрожжей на три группы может быть продолжено «более подробной» классификацией с использованием многофакторного статистического анализа, распределяющего штаммы по различным кластерам ДВПП [57, 136, 192]. Молекулярные методы до сих пор не имеют технологической значимости и могут использоваться для подтверждения идентичности видов или получения дополнительной внутривидовой информации носче первичного скрининга посредством анализа жирнокислотного состава. «Отрицательные» тесты с использованием молекулярных зондов или праймеров не дают информации о возможной идентичности видов дрожжей, в связи с чем для снижения количества подлежащих тестированию зондов или праймеров их следует применять только после жирнокислотного анализа. В заключение следует отметить, что наиболее важным достоинством жирнокислотного анализа является не его специфичность (молекулярные методы имеют большую таксономическую значимость), а возможность объединения видов дрожжей в группы, характеризующиеся различной технологической значимостью. Такой подход применялся для обнаружения Z. bailiiпри розливе вин [136] и в концентратах фруктовых соков [192], а D. bruxellensis – в винах [57]. Широкому его внедрению препятствует отсутствие легко доступных баз данных и сложность интерпретации жирнокислотного состава в производственных условиях – недостаток, характерный и для оценки гель-электрофоретических спектров (в молекулярных методах). Если среда позволяет ограничить разнообразие микрофлоры одним или несколькими видами дрожжей, то можно избежать жирнокислотного профилирования. При обнаружении предполагаемых колоний для подтверждения их идентичности можно использовать одни или несколько молекулярных зондов или праймеров [57].

12.5.1.4. Ускоренное инкубационное тестирование

Ускоренные инкубационные тесты распространены, в частности, в пивоваренной и консервной промышленности. Существуют три варианта их применения: первый проводится непосредственно на пищевом продукте с созданием для присутствующей микрофлоры благоприятных условий роста (например, инкубация при 25-30 °С), второй проводится непосредственно на пищевом продукте с созданием благоприятных условий для роста определенного штамма ДВПП, инокулированного в образец, а третий представляет собой инокулирование образцов продукта в подходящую культуральную среду с более благоприятными условиями для роста микроорганизмов, чем собственно в пищевом продукте. Первый вариант по сути идентичен производственному карантинному режиму, которому подвергаются упакованные продукты с высокими уровнями контаминации – продукты поступают на реализацию, если они после длительного периода инкубации оказываются микробиологически стабильными [4, 129, 216]. В пивоварении этот «форсированный тест», восходящий к началу XX в., включает выдерживание пива при повышенной температуре до 6 недель [72]. Во втором варианте тестирования (длительностью 18 ч [92]) оно применялось для прогнозирования срока хранения фруктовых йогуртов, а последний вариант [205] – для вин, где для выявления скорости роста ДВПП использовались относительно короткие периоды инкубации (72 ч) с последующей биолюминесценцией.

12.5.2. Приемлемые уровни содержания дрожжей и прогнозирование срока годности пищевых продуктов

Определение приемлемых уровней содержания микроорганизмов в готовых пищевых продуктах – обычная задача для многих пищевых отраслей. Цель технолога состоит в соблюдении приемлемых уровней содержания микроорганизмов и обеспечении стабильности продукта в течение всего срока хранения. Литературы но вопросам определения уровней приемлемости и прогнозирования дрожжевой порчи пищевых продуктов очень мало, что свидетельствует о той низкой роли, которую отводят этому аспекту микробиологи и технологи, работающие в пищевой промышленности.

Вызвать порчу отдельной упаковки готового продукта может одна жизнеспособная клетка вирулентного штамма дрожжей, в связи с чем требования к приемлемым уровням содержания микроорганизмов следует устанавливать достаточно строгими, как, например, это рекомендуется для Z bailii в виноделии [46, 204] и производстве газированных безалкогольных напитков [167], а также для S. cerevisiae var. diastaticus и Dekkera/Breltanomyces spp, в пивоварении [4]. При оценке риска развития дрожжевой порчи можно руководствоваться следующим правилом: в газированных напитках может присутствовать не более 100 дрожжевых клеток на литр, а в 10 г фруктового концентрата не должны быть обнаружены Z bailii/Z. bisporus [216],

Что касается прогнозирования микробиологической порчи, то замечательным исключением из немногих работ в этой области является работа Делле (Delle), выполненная в Одессе в начале XX в. (цит. по [2]), хотя она и касалась только десертных вин. Из нее следует, что биологическая стабильность вина достигается в том случае, когда сумма содержания сахаров (% масс.) (в ед. Делле) и шестикратного содержания этанола (% масс.) составляет не менее 78. Другие значения сумм единиц Делле, обеспечивающие стабильность, использовали в Калифорнии применительно к виноградному суслу, подвергаемому различным типам брожения [2], и к десертным и сухим столовым винам [226]. Несколько прогностических моделей (в основном по патогенным бактериям) для вин, а также для ингредиентов с высокой кислотностью и низкими значениями αω содержатся в недавно выпущенном пакете программ – Food MicroModel, version 2 [8]. К сожалению, такие прогностические модели еще редко применяются и промышленности, где, как правило, по-прежнему предпочитают классически способ «общего подсчета жизнеспособных клеток». До сих пор не ясно, является ли это отношение следствием недостатка новых моделей или просто сопротивления к изменениям устоявшейся практики.

12.5.2.1. Приемлемые уровни содержания дрожжей в пищевых продуктах в ходе производства и реализации

Результаты проверки ряда предприятий по производству пива, вин и фруктовых соков выявили относительно низкийуровень содержания дрожжей [4]. Производитель стремится обеспечить безопасность своей продукции, поэтому уровень контаминации выпускаемых продуктов оказался очень низким. Зачастую максимальный приемлемый уровень составлял менее одной дрожжевой клетки на 100 мл, хотя такие низкие значения не являются статистически достоверными. Как правило, количественные характеристики контаминирующей микрофлоры были получены после культивирования микроорганизмов на среде общего назначения, поэтому эти результаты отражают общее количество микрофлоры, а не количество ДВПП. Если уровни содержания дрожжей оказываются выше приемлемых, на большинстве пищевых предприятий продукт достаточное время выдерживают, и если содержание дрожжей не соответствует техническим требованиям, его отправляют на переработку. Такой подход требует времени, однако дает полную картину коптами пирующей продукт микрофлоры. В случае увеличения численности микроорганизмов продукт, вероятнее всего, оказывается контаминирован ДВПП. Большинство пищевых предприятий, осуществляющих контроль контаминации готового продукта дрожжами, контролируют также эффектность санитарно-гигиенических мероприятий. Более того, некоторые их заказчики из оптовой или розничной торговли сами контролируют соблюдение GMP («правильной производственной практики»), следовательно, у них существуют микробиологические критерии уровней приемлемости пищевых продуктов. Имеются также микробиологические критерии приемлемых уровней для технологических и санитарно-гигиенических операций – обязательные для соблюдения требований НАССР и ISO9000. Таким образом, анализ конечного продукта следует рассматривать как окончательную проверку всего технологического цикла.

Прежде чем устанавливать микробиологические критерии, необходимо стандартизировать аналитические процедуры – отбор образцов, размер выборки, выбор разбавителей, культуральных сред и условий инкубации. Применяемые в настоящее время методики значительно отличаются, что затрудняет сравнительную оценку результатов. Контракты, заключаемые производителями пищевых продуктов с заказчиками из оптовой торговли, также предусматривают микробиологические критерии, принятые на производстве. Производители пищевых продуктов могут являться разработчиками технических условий, которые действуют также в розничной торговле. Технические условия для розничной торговой сети не должны быть более жесткими, чем те, которые действуют в пищевых отраслях.