14.1. ЛАБОРАТОРНАЯ СТАДИЯ РАЗВЕДЕНИЯ^***

Разведение чистой культуры дрожжей осуще­ствляется путем последовательного пересева с доведени­ем объема среды до производственной дрожжанки или дрожже­генератора. Оптимальным режимом прироста объ­ема среды принято считать шаг 1:10.

Лабораторная стадия разведения дрожжевой культу­ры требует непременного соблю­дения следующих условий:

• обязательное сохранение чистоты культуры;
• максимально возможная сбалансированность пита­тельной среды;
• постепенный переход физико-химических парамет­ров культивирования от лабораторных к технологическим с целью поддержания щадящих режимов адаптации.

Очередную разводку можно начать культурой на ско­шенном агаре, смыв ее солодовым суслом или физраство­ром. Для этого в пробирку с дрожжами вносят 5–10 см³ стерильной жидкой среды и выдерживают в термостате при 28–30°С в течение 2–3 ч. После непродолжительного инкубирования содержимое пробирки перемешивают ме­жду ладо­нями, смывая дрожжевой рост с поверхности агара.

Такой вариант экономит несколько дней, однако име­ет существенные недостатки:

• нет подтверждения чистоты культуры, особенно если пробирка с дрожжами хра­нилась длительное время;
• нет возможности отбора наиболее активной колонии по культуральным и фермен­тативным свойствам.

Исключить возможные ошибки можно, начав развод­ку с пересева коллекционной культуры используемых дрожжей на поверхность сусло-агара в чашке Петри.

Инокулят отбирается петлей с поверхности косого ага­ра и рассевается штрихом непосредственно в чашку Пет­ри, либо предварительно вносится в жидкую среду, пере­мешивается до однородной суспензии и рассевается исто­щающим штрихом. Чашки инкубируются при 28–30°С в течение 5–7 дней.

По окончании инкубации при малом увеличении тща­тельно отбираются 2–3 лучшие по культуральным свой­ствам колонии, из которых в разводку пойдет наиболее активная по ферментативным свойствам (см. главу 9). От­сев на скошенный агар от этой колонии можно смыть жид­кой средой, как указано выше.

Полученную в пробирке дрожжевую суспензию сте­рильно переливают в колбу с 50 см³ стерильного солодо­вого сусла с 0,3% дрожжевого автолизата и инкубируют
22–24 ч при 28–30°С.

На следующем этапе объем среды доводят до 500 см³, при этом 1/2 ее часть следует заменить стерильным про­изводственным суслом (виноградное сусло, меласса и др.). Стерильно переносят в нее содержимое предыдущей кол­бы. Температурный режим и время инкубации те же.

Объем среды на следующем этапе составит 5000 см³, 1/2 ее часть следует снова заменить стерильным произ­водственным суслом. Если технологические параметры преду­сматривают низкие температуры брожения, следу­ет на этом этапе для инкубации выбрать промежуточный температурный режим.

На следующем этапе объем среды увеличивается в 10 раз, и снова 1/2 его объема заменяется производствен­ным суслом. Автоклавирование такого объема может пред­ставлять определенные трудности, поэтому для предупре­ждения инфицирования следует прибегнуть к дополни­тельному дробному кипячению в течение двух дней или исполь­зованию противомикробных препаратов в бактери­цидных дозах. Температура инкубации должна соответ­ствовать технологическим параметрам.

Дальнейшие процедуры определяются особенностями аппаратурно-технологической схемы конкретного произ­водства и его регламентом, предписывающим порядок ве­дения ЕЧК.

На всех этапах лабораторной стадии разводочного цик­ла целесообразно включать в состав питательных сред фак­торы роста и биологически активные добавки.

В частности, в пивоварении активирование дрожжей перед введением в сбраживаемый субстрат рекомендуется осуществлять несколькими способами.

1. Дрожжи разбавляют в соотношении 1:1 стерильным аэрированным суслом при
   15–17,5°С, после чего смеши­вают только с частью (1/4–1/3) холодного сусла во избе­жание охлаждения дрожжей, которое задерживает их рост и может усилить развитие посто­ронней микрофлоры.
2. Через 24 ч после введения дрожжей забродившее сусло смешивают со свежим суслом (1:1). Жидкие дрож­жи вводят в сусло из расчета 11–18% на сухое вещество от общего количества сухих веществ в сусле.
3. Заливают дрожжи первым суслом на 2–4 ч для уве­личения содержания гликогена в клетках.
4. Вносят в дрожжи водные вытяжки или экстракты солодовых ростков, богатых биологически активными ве­ществами и азотом.

Для введения в следующий цикл брожения использу­ют здоровые активные производ­ственные дрожжи.

14.2. МЕТОДЫ РЕАКТИВАЦИИ СУХИХ ДРОЖЖЕЙ

Эффективные способы восстановления жизне­способности высушенных дрожжевых клеток имеют боль­шое значение при определении комплекса показателей жизне­способности сушеных дрожжей – ферментативной активности, подъемной силы и содер­жания в них мерт­вых клеток.

Правильно проведенная регидратация сухих дрожжей в щадящем осмотическом режиме также имеет важное значение для их дальнейшего производственного использования.^***

14.2.1. РАЗМАЧИВАНИЕ ДРОЖЖЕЙ ПРИ ПОВЫШЕННОЙ ТЕМПЕРАТУРЕ

Навеску дрожжей 2,5 г размачивают в 30 см³ воды тем­пературой 40–43°С, в остальном поступают так же, как при определении подъемной силы и других характеристик прессованных дрожжей.

14.2.2. ПРЕДВАРИТЕЛЬНОЕ ОБВОДНЕНИЕ

2,5 г (в зависимости от поставленной задачи массу на­вески можно изменить) дрожжей, подлежащих анализу, помещают на 2 ч во влажную камеру (в чашку Петри, на дно которой положен кружок фильтровальной бумаги, обильно смоченный водой) при температуре 30–35°С, че­рез 2 ч увлажнившиеся дрожжи переносят в фарфоровую чашку или стаканчик и заливают 30 см³ воды температу­рой 40–43°С, и далее поступают в соот­ветствии с воспро­изводимой методикой.

14.2.3. РЕАКТИВАЦИЯ ВИННЫХ СУХИХ ДРОЖЖЕЙ

В виноделии находят применение сухие дрожжи взамен жидких разводок. Применение их значительно снижает стоимость приготовления разводки в больших количествах.

Фирма «Эрбсле» (Erbsloh) по производству сухих дрож­жей «Гайзенхайм» (Германия) рекомендует дозирование препаратов сухих дрожжей в зависимости от условий тех­нологии: 10–15 г/100 дм³ сусла при температуре 15°С и выше; 20–25 г/100 дм³ при тем­пературе 13°С и ниже (1 г сухих дрожжей содержит 25 млрд клеток).

Таблица 20

Схемы регидратации сухих дрожжей

Регидратацию сухих дрожжей (весовое необходимое количество) рекомендуется проводить в зависимости от условий виноделия (температура, качество винограда) по двум схемам, показанным в таблице 20.

Для обеспечения полного активного сбраживания сус­ла рекомендуются в качестве дополнительного питания дрожжей препараты, содержащие соединения азота – (NН₄)₂НРO₄, углеводов, минеральных веществ и витами­нов – витамина В₁ (тиамина).

14.2.4. РЕАКТИВАЦИЯ СПИРТОВЫХ СУХИХ ДРОЖЖЕЙ^***

Технология производства товарных дрожжей для лю­бой из отраслей бродильной промышленности – это во всех отношениях максимально сбалансированный процесс. Од­нако завершающий этап этого процесса – сушка – явля­ется процедурой крайне жесткой, наносящей клетке серь­езные, а часто необратимые повреждения на биомолекуляр­ном уровне. Вызваны такие нарушения воздействием на клетку высокой температуры при быстром удалении внут­риклеточной влаги. Наибольшему повреждению подверже­на клеточная стенка, в которой нарушается пористость, деградируют транспортные и ферментные системы, резко повышается осмотическая чувствительность.

Возвращение клетки к нормальной, насколько это воз­можно, физиологической активности должно происходить постепенно с учетом вышеперечисленных обстоятельств.

Для регидратации вместо проточной воды рекоменду­ется использовать физиологический раствор (0,9% раствор NaCl в дистиллированной воде), который является изото­ническим и не вызывает функциональной перегрузки био­логических мембран при восстановлении влажности.

Регидратацию лучше проводить при низких температу­рах (2–4°С), так как из поврежденных в процессе сушки клеток в раствор выходит значительное количество лизирующих ферментов, восстанавливающих свою активность при высоких температурах и вызывающих более или менее серьезные повреждения клеточных стенок живых дрожжей.

Для полного удаления ферментов этой группы и мерт­вых клеток из суспензии целесообразно применять про­цедуру промывания регидратированных дрожжей.

Гарантировать бактериологическую чистоту процесса регидратации можно при соблюдении всех правил работы с чистой культурой и использовании противомикробных препаратов в соответствующих дозах.

На основании вышеизложенного рекомендуется ста­дию регидратации проводить следующим образом:

1. Необходимое количество сухих дрожжей рассыпать равномерно по всей площади зеркала холодного физрас­твора (с антибиотиком) в соотношении 1:30–1:50 и без пе­ремешивания дать отстояться в холодильнике до полного увлажнения и образования стабильного осадка.
2. Осторожно слить надосадочную жидкость и снова залить холодным физраствором. Процедуру повторить 2–3 раза.
3. Для разбраживания использовать только тщатель­но промытый дрожжевой осадок.

Разбраживание предпочтительнее проводить в низко­концентрированной, тщательно сбалансированной пита­тельной среде в маточнике, оснащенном системой интен­сивной аэрации стерильным воздухом, и при жестком кон­троле температуры в пределах 28–30°С.

При соблюдении таких условий будут решаться не­сколько задач:

• аэробная стадия метаболизма;
• максимально возможное восстановление генератив­ной и бродильной активности для последующих стадий тех­нологического процесса (дрожжанка, бродильный чан);
• щадящий режим разбраживания;
• интенсивный прирост биомассы.

Непременным условием культивирования дрожжей на этой стадии является биологи­ческая чистота. Добиться этого можно либо дополнительным кипячением сусла, либо использованием противомикробных препаратов.

Культивирование дрожжей в дрожжанках является последним и основным звеном в формировании здоровой, физиологически активной дрожжевой массы. На этой ста­дии дрожжи перестраиваются на интенсивное брожение, которое с максимальной эффектив­ностью должно про­явиться в период главного брожения. Достижению этой цели способствуют:

• сбалансированность питательной среды по всем па­раметрам;
• биологическая чистота процесса;
• оптимальный температурный режим;
• оптимальная засевная доза.

Для дрожжевого отделения в качестве источника азо­та предпочтительнее использовать соответствующие дрож­жевые препараты вместо общепринятого карбамида или хотя бы часть его заменить такими препаратами.

В питательную среду необходимо включать препара­ты веществ, относящиеся к группе факторов роста.

Энергетически неэффективные и физиологически жест­кие анаэробные условия культи­ви­рования необходимо сгла­живать соответствующими препаратами, позволяющими дрож­жам даже без доступа кислорода активно размножать­ся, сохраняя общий физиоло­гический потенциал.

Температурный режим культивирования (28–30°С) дол­жен соответствовать нормальной скорости течения внутри­клеточных биохимических процессов и не ставить клетку в условия гиперфункционирования со всеми вытекающими последствиями (быстрая деградация культуры, ранние автолизные процессы, образование большого количества ток­сичных продуктов незавершенного метаболизма).

Крайне важно, что соблюдение температурного режи­ма позволит значительно замедлить рост посторонней микрофлоры и создать условия для доминирования дрож­жевой клеточной биомассы. Ввиду короткого периода дрожжегенерации влияние посторонней микрофлоры в дрожжанке не всегда заметно. Но, получая здесь разви­тие, она в огромных инфицирующих количествах перено­сится в бродильный чан, где в полной мере оказывает свое негативное влияние на ход и качество брожения.