Время от времени культуры, как в коллекци­ях, так и в промышлен­ности, проверяют на наличие за­грязнений или на появление мутантов.

Перед использованием в производстве пробы засевных дрожжей должны пройти проверку на жизнеспособность. Считается правильным проверять каждую партию семен­ных дрожжей на допустимое количество (а лучше всего вообще отсутствие) контами­нирующих бактерий и диких дрожжей. Для бактерий рекомендуется использовать в основном актидионовый WL-aгap или другие среды диф­ференциального назначения, а для диких дрожжей (не Saccharomyces) – лизиновый агар. Для обнаружения «ди­ких» дрожжей среди сахаромицетов делают рассев репли­катором на лизиновый агар (углеродная основа + 0,1% L-лизина как единственного источника азота), на кото­ром S. cerevisiae и S. carlsbergensis не растут, а «дикие» дрожжи растут. Но если контаминанты Saccharomyces окажутся стойкими к циклогексимиду (что встречается довольно редко), определить их будет невозможно. Одна­ко следует иметь в виду, что не существует такой селек­тивной среды, которая бы одновременно подавляла рост культурных дрожжей и допускала бы развитие всех при­сутствующих контаминантов. Тем не менее дикие дрож­жи рода Saccharomyces образуют споры и могут быть выде­лены благодаря своей тепло­стойкости (сравнительно с неспорообразующими культурными дрожжами). При этом, однако, для инкубации требуется не менее трех суток, а задерживать на это время внесение дрожжей непрактич­но. Таким образом, этот анализ может служить лишь для проверки качества постфактум.

Petite или RD-мутанты (дефектные по дыханию) на сусло-агаре образуют окрашенные мелкие колонии. На среде с теллуритом они не восстанавливают последний.

15.1. ПРОСМОТР КУЛЬТУРЫ ПОД МИКРОСКОПОМ

Контролю подвергают односуточную культуру из жидкого солодового сусла плот­ностью 10­–12% СВ. Одну каплю культуры при помощи стерильной пипетки нано­сят на чистое предметное стекло и накрывают покровным стеклом (оба стекла предварительно протирают спиртом).

Приготовленный препарат помещают на предметный столик микроскопа и просматривают десять полей зрения при увеличении в 600–800 раз. При просмотре их не долж­но быть обнаружено ни посторонних дрожжевых грибков, ни бактерий.

15.2. МЕТОД МИКРОКУЛЬТУРЫ

Для определения посторонних дрожжевых гриб­ков применяют метод микрокультуры. Этот метод удобен для получения быстрого ответа о составе микрофлоры.

На дно чашки Петри кладут фильтровальную бумагу, вырезанную по форме чашки. Туда же помещают две стек­лянные палочки, предметное и покровное стекла и все сте­рилизуют сухим жаром в течение 1 ч при 160°С. Стериль­ной стеклянной палочкой наносят на стерильное предмет­ное стекло каплю исследуемого образца, к этой капле прибавляют 2–3 капли 1%-ного сусло-агара, предвари­тельно расплавленного на водяной бане и охлажденного до 50–45°С. Смешивают агар с жидкостью уголком сте­рильного покровного стекла и накрывают им получивший­ся таким образом препарат. Фильтро­вальную бумагу в чашке Петри смачивают стерильной водой, препарат по­мещают в чашку Петри на стеклянные палочки и ставят в термостат при температуре 30°С.

Через 6-8 ч ведут наблюдение за формой выросших микроколоний под микроскопом. Просматривают 20 по­лей зрения  в середине препарата и по краям. В каждом поле подсчитывают отдельно микроколонии как сахаро­мицетов, состоящие из круглых или овальных клеток, так и посторонних дрожжевых грибков, обычно очень резко выделяющихся по своему внешнему виду и форме клеток.

Определяют среднее количество колоний сахаромице­тов и посторонних дрожжевых грибков и рассчитывают их процентное соотношение.

15.3. ПОСЕВ НА ЧАШКИ ПЕТРИ

Пробу из культуры, предварительно разведен­ную в стерильной водопроводной воде, наносят на поверх­ность твердой питательной среды, инкубируют при опти­мальных условиях и определяют наличие неспецифических колоний. На поверхности питательной среды в чашках Петри чистая культура образует однородные по морфоло­гии, консистенции и пигментации колонии.

15.4. ПОСЕВ НА ЭЛЕКТИВНУЮ ПИТАТЕЛЬНУЮ СРЕДУ

Степень засоренности чистой культуры, маточ­ных и засевных дрожжей посторонними дрожжевыми и дрожжеподобными грибами оценивают при помощи элек­тивной ацетатной среды, где имеются благоприятные ус­ловия для размножения диких дрожжей, а сахаромицеты не размножаются. Благодаря этому представляется воз­можным выявить в исследуемом материале даже единич­ные клетки диких дрожжевых грибов.

Исследуемый материал — 1–2 капли взвеси исследуе­мых дрожжей — вносят в пробирку с ацетатной средой. Посев производят с соблюдением всех правил асептики — над пламенем горелки, стерильной пипеткой или предва­рительно прокаленной петлей.

Засеянную пробирку помещают в термостат при тем­пературе 30°С и ведут за ней ежедневные наблюдения. Появление пленки на поверхности среды или помутнение ее указывает на наличие в исследуемом материале посто­ронних дрожжевых грибов. Чем раньше появится пленка, тем более инфицированным является материал. Быстрота появления пленки позволяет дать оценку степени заражен­ности материала посторонними дрожжевыми грибами.

Если пленка появилась через 5 или большее число дней либо совсем не появилась, то это означает, что культура чистая, материал не содержит посторонних дрожжей в значимых для производства количествах; если же пленка появилась через 3–4 дня, то дрожжи ЧК или ЕЧК удовле­творительные и пригодны для работы; если пленка поя­вилась через 1–2 дня, то дрожжи ЧК и ЕЧК неудовлетво­рительные и не пригодны для работы.

По истечении сроков инкубации необходимо провести микроскопирование и пересев пробы на сусло-агар для анализа культуральных свойств.

15.5. ПОВСЕДНЕВНЫЙ  МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ  КОНТРОЛЬ  ПРОЦЕССА ВЫРАЩИВАНИЯ  ХЛЕБОПЕКАРНЫХ  ДРОЖЖЕЙ

Для контроля процесса в пробах культуральной среды из дрожжерастильных аппаратов под микро­скопом при увеличении в 800–1000 раз выполняют сле­дующие анализы.

1. Подсчитывают число почкующихся клеток (в %). Их количество должно нарастать с 30 до 40% в начале цикла и до 80–90% к пятому часу и постепенно спадать к концу цикла. В непрерывной культуре на стадии отбора число почкующихся клеток должно быть постоянным — 40–50%.
2. Определяют количество мертвых клеток (в %), ок­рашенных метиленовым синим. Их количество не долж­но превышать 1–2 в поле зрения. Повышенное содержа­ние мертвых клеток, наличие мертвых или двойных по­чек свидетельствует о содержании в среде ингибиторов (нитритов, оксидов меди, серебра, ртути, кадмия) или о нарушениях технологического режима.
3. Определяют размеры клеток и их физиологическое состояние. В нормальных условиях выращивания клетки должны быть однородными, содержание мелких клеток не должно превышать 20–25%. Зернистость, большое чис­ло мелких клеток (35–50%) при малом количестве поч­кующихся свидетельствует об отсутствии в среде росто­вых или зольных веществ, а также о нарушениях режи­мов температуры, рН и аэрирования.
4. Определяют микробиологическую чистоту культу­ральных сред. На всех стадиях производства маточных дрожжей ЧК и ЕЧК не должно быть ни бактериальной, ни дрожжевой инфекции, как в жидкости, так и в пене.

На стадии засевных дрожжей в конце цикла допуска­ется наличие в пене 1–2 клеток несахаромицетов и бакте­рий на 10–15 полей зрения. В товарных аппаратах в нача­ле цикла могут встречаться единичные клетки посторон­них дрожжей с нарастанием их количества до 10–15% в конце цикла и в отборочных аппаратах. Бактерий не долж­но быть более 1–2 в поле зрения.

Обнаружив повышенное содержание мертвых и мелких клеток, зернистость и малое количество почкующихся, сле­дует проверить соблюдение всех параметров технологии.