20.1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОБЩЕГО АЗОТА В ПРЕССОВАННЫХ ДРОЖЖАХ

В товарных дрожжах обычно содержится 1,65–1,8% азота, в засевных – 2,0–2,2%, а в маточных – 2,2–2,4% азота.

Анализу подвергают пробы на любом этапе технологи­ческого процесса от каждого затора или от каждой пар­тии дрожжей.

Общий азот в прессованных дрожжах определяют по методу Кьельдаля.

Около 4 г прессованных дрожжей отвешивают в бюксе на аналитических весах с точностью до четвертого знака и переносят в колбу Кьельдаля. Остаток дрожжей в бюксе взвешивают и по разности определяют вес взятой навес­ки. В колбу наливают 20 см³ концентрированной серной кислоты «ХЧ», помещают 2–3 крупинки селена или око­ло 1 г сернокислой меди и около 10 г сернокислого калия. Если в дальнейшем в этой же навеске дрожжей определя­ют и фосфор, сжигание с медью производить нельзя. Со­держимое колбы осторожно смешивают, слегка вращая колбу, и закрывают ее специальной стеклян­ной пробкой с расширением, неплотно вставляющейся в горло колбы.

Затем колбу ставят в наклонном положении в вытяж­ной шкаф на нагревательный прибор (плитку или газо­вую горелку). Сначала сжигание ведут при слабом на­гревании, при этом происходит обугливание и выделе­ние сернистого газа, затем, когда выделение газа станет более равномерным, нагревание усиливают. Когда жид­кость перестанет пениться, обуглившиеся, но несгоревшие комочки вещества, приставшие к стенкам, осторожным помешиванием смывают в жидкость, которая постепенно становится совершенно прозрачной. Прозрачную жид­кость нагревают еще 1–2 ч.

Рис. 39

Прибор для определения азота по Кьельдалю

После сжигания содержимое колбы Кьельдаля смеши­вают с небольшим количеством воды и переливают в мер­ную колбу емкостью 250 см³, споласкивают колбу Кьель­даля еще 2–3 раза и промывную воду сливают в ту же мер­ную колбу. Затем содержимое ее доводят водой до метки, хорошо перемешивают и переводят в колбу для отгона ам­миака.

Перегонку производят или в специальном приборе, где можно одновременно проводить несколько определений, или в аппарате (рис. 39), который собирают следующим образом: круглодонную или плоскодонную колбу емкос­тью 1 л устанавливают на штатив, соединяют ее плотной резино­вой пробкой с каплеуловителем, а затем с холо­дильником. В пробку, кроме трубки каплеуловителя, встав­ляют стеклян­ную трубку, соединенную кау­чуковой трубкой с небольшой воронкой диаметром 4–5 см; на каучуковой трубке имеется вин­товой зажим.

К другому концу холодиль­ника присоединяют стеклян­ную трубку с шарообразным расши­рением в верхней части, кото­рую опускают почти до дна при­емника. Приемником может служить обычная коническая колба емкостью 500 см³. Все час­ти прибора должны быть плотно пригнаны. В приемник налива­ют 50 см³ 0,1 Н раствора серной кислоты и 1–2 капли раствора метилрот и устанавливают его так, чтобы конец трубки с шарообразным расширением был погружен в кислоту.

Содержимое колбы Кьельдаля после охлаждения раз­бавляют дистиллированной водой небольшими порция­ми и сливают через воронку в колбу для отгонки. Колбу Кьельдаля ополаскивают несколько раз водой с таким расчетом, чтобы общий объем жидкости составлял око­ло 400–500 см³. Колбу помещают на штатив и собирают аппарат, как было указано выше. Затем открывают вин­товой зажим воронки и наливают 50–100 см³  33%-ного раствора едкой щелочи. Воронку смывают небольшим ко­личеством дистиллиро­ванной воды, завинчивают зажим и содержимое колбы взбалтывают. Наличие в колбе для отгонки избытка щелочи устанавливают при помощи кусочка лакмусовой бумажки, брошенной в колбу. Лак­мусовая бумажка синеет.

Колбу для отгонки подогревают горелкой и отгоняют аммиак с водяными парами до тех пор, пока капля отгона не перестанет вызывать посинения красной лакмусовой бумажки. Для этого достаточно отогнать из колбы около половины всей жидкости.

По окончании отгонки конец трубки, опущенный в кислоту, споласкивают водой в приемник и содержимое приемника титруют 0,1 Н раствором щелочи. Затем опре­деляют количество миллилитров 0,1 Н раствора едкого натра, израсходованного на титрование серной кислоты, не связавшейся аммиаком, после чего производят расчет. Количество связанной кислоты соответствует выделивше­муся аммиаку. 1 см³ 0,1 Н щелочи соот­ветств­ует 1,40 мг азота.

Если параллельно с определением азота производят определение фосфора, то из мерной колбы сначала отби­рают 50 мл для этого определения, а остальной раствор переводят в колбу для отгона аммиака.

Содержание азота (N) в процентах вычисляют по сле­дующей формуле:

где a – количество 0,1 Н раствора серной кислоты, нали­той в приемник, в см³ (1 см³ 0,1 Н раствора серной кисло­ты соответствует 0,0014 г азота); б – количество 0,1 Н раствора щелочи, затраченное на титрование, в см³; р – навеска дрожжей в г.

Общее количество белковых веществ вычисляют пу­тем умножения количества общего азота на коэффици­ент 6,25.

Пример. Для анализа взято 4,8200 г дрожжей. Для определения фосфора отобрана 1/5 часть, что составляет 4,82 : 5 = 0,964 г; для определения азота взято 4,8200 – 0,964 = 3,8560 г. В приемник налито 75 см³ 0,1 Н серной кислоты, на титрование оставшейся свободной кислоты затрачено 22,4 см³ 0,1 Н раствора едкого натра. Аммиа­ком связано
75 – 22,4 = 52,6 см³ кислоты. Следовательно, содержание азота в дрожжах составит

20.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФОСФОРНОГО АНГИДРИДА В ДРОЖЖАХ

В прессованных дрожжах содержится от 0,7 до 1,4% Р₂O₅. Содержание фосфорного ангидрида в дрожжах определяют колориметрическим методом Бриггса или при помощи фотоэлектроколориметра.

20.2.1. МЕТОД БРИГГСА

Визуальный метод. Принцип метода основан на обра­зовании фосфорномолибденовой кислоты и ее восстанов­лении гидрохиноном и Na₂SO₄ с образованием устойчи­вой синей окраски. Интенсивность окраски возрастает пропорционально количеству неоргани­ческого фосфора в испытуемой пробе.

Навеску прессованных дрожжей около 1 г помещают в колбу Кьельдаля и сжигают ее так же, как при определе­нии общего азота. После сжигания содержимое колбы пе­реводят в мерную колбу емкостью 100 см³. Колбу Кьель­даля несколько раз ополаскивают водой, которую также сливают в мерную колбу, затем содержимое колбы дово­дят водой приблизительно до 50 см³, нейтрализуют 33%-ным раствором едкого натра и доливают водой до метки, т. е. до объема 100 см³, и хорошо перемешивают. Из при­готовленного таким образом раствора отбирают 1 см³ в пробирку высотой 70 мм и диаметром 15 мм. Одновремен­но в семи других пробирках такого же размера готовят стандартный ряд с определенными, все увеличивающими­ся концентрациями фосфора: 0,01; 0,02; 0,03; 0,04; 0,05; 0,06; 0,07 мг фосфора в 1 см³.

В первую из семи пробирок наливают 0,1 см³ стандарт­ного раствора КН₂РO₄, что соответствует 0,01 мг фосфо­ра; во вторую – 0,2 см³, т. е. 0,02 мг фосфора; в третью – 0,3; в четвертую – 0,4; в пятую – 0,5; в шестую – 0,6; в седьмую– 0,7 см³. Затем в первую пробирку доливают 0,9 см³ воды, во вторую – 0,8, в третью – 0,7, в четвер­тую – 0,6, в пятую – 0,5, в шестую – 0,4, в седьмую – 0,3. Таким образом, в каждой из семи пробирок объем жидкости равняется 1 см³.

Затем в каждую из восьми пробирок наливают по 1 см³ молибденового раствора, по 1 см³ раствора гидрохинона и по 1 см³ раствора безводного сульфита. После взбалтыва­ния содержимое пробирок окрашивается в различные по интенсивности оттенки синего цвета – от светло-синего до темно-синего. Пробирки оставляют стоять на 20 мин, после чего сравнивают окраску пробирки с испытуемой жидкостью с окраской каждой из семи пробирок, содер­жащих стандартный раствор. Содержание фосфора в ана­лизируемых дрожжах рассчитывают по формуле

где A – содержание Р₂O₅ в прессованных дрожжах в %; а – содержание фосфора в пробирке с испытуемым веще­ством (по стандартному ряду); б – разведение; В – навес­ка вещества (в пересчете на 75% влаги); 2,29 – коэффици­ент перевода Р в Р₂O₅ (частное от деления молекулярного веса Р₂O₅ на молекулярный вес фосфора – 142 : 62 = 2,29); 100 – пересчет на проценты; 1000 – перевод мг в г.

Пример. Цвет пробирки с испытуемым раствором соответствует цвету пробирки стандартного ряда, содер­жащей 0,04 мг фосфора. Подставляем наши данные в фор­мулу и производим расчет содержания Р₂O₅ в прессован­ных дрожжах:

Растворы для определения фосфора по методу Бриггса.

1. 5%-ный молибденовый раствор. 25 г молибденовокислого аммония растворяют в 300 см³ дистиллированной воды, к полученному раствору добавляют 75 см³ концен­трированной серной кислоты, разбавленной 120 см³ воды; общий объем раствора доводят водой до 500 см³.
2. Свежеприготовленный 1%-ный раствор гидрохино­на. К 100 см³ раствора добав­ляют каплю концентрирован­ной серной кислоты для предотвращения окисления.
3. 20%-ный раствор безводного сульфита (Nа₂SO₃). Вследствие окисления сульфитный раствор портится при долгом хранении, поэтому пользуются свежеприготовлен­ным раствором.
4. Стандартный раствор кислого фосфорнокислого ка­лия. Готовят из чистой соли КН₂РО₄, которую предваритель­но измельчают и высушивают в эксикаторе в течение не­скольких дней. 4,394 г соли растворяют в дистиллирован­ной воде (1 дм³) и добавляют несколько капель хлороформа как антисептика. 1 см³ раствора содержит 1 мг фосфора. 100 см³ этого раствора разбавляют водой до 1 дм³ и получа­ют раствор, в 1 см³ которого содержится 0,1 мг фосфора.

Фотоэлектроколориметрический метод. В модельных растворах стандартного ряда пробирок определяют опти­ческую плотность с помощью прибора ФЭК и строят ка­либровочный график. На оси абсцисс откладывают коли­чество фосфора, а на оси ординат – оптическую плотность. Для данной шкалы стандартного ряда пробирок график будет постоянным.

Определив на приборе ФЭК оптическую плотность про­бирки с испытуемым раствором, по графику находят со­ответствующее ей содержание фосфора в пробирке.

20.3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ЗОЛЫ

В прессованных дрожжах содержание золы обычно колеблется от 1,6 до 2%. В пересчете на прессован­ные дрожжи с содержанием 75% влаги оно не должно быть выше 2,5%, а на сухое вещество дрожжей – не более 10%.

Около 2 г прессованных дрожжей отвешивают на ана­литических весах с точностью до четвертого знака в пред­варительно прокаленном платиновом или фарфоровом тигле. Навеску предварительно подсушивают при темпе­ратуре 70–80°С; когда консистенция дрожжей станет та­кой, что можно не опасаться разбрызгивания, добавляют 8–10 капель серной кислоты удельным весом 1,84, разме­шивают оплавленной стеклянной палочкой, вытирают палочку маленьким кусочком фильтровальной бумаги, который также бросают в чашку и, держа чашку щипца­ми, осторожно нагревают на небольшом пламени горелки под тягой. Когда масса перестанет пениться и выделение паров и газов прекратится, ее окончательно сжигают и прокаливают до постоянного веса в муфеле при слабом калении или на горелке, при этом доводят платиновую чашку или тигель до слабо-красного каления.

Сжигание навески считается законченным, когда вся масса превратится в белый или розовый порошок, не со­держащий черных частиц несгоревшего вещества. Затем чашку или тигель переносят в эксикатор, охлаждают и взвешивают.

Полученный вес сернокислой золы для перевода на условную углекислую золу умножают на коэффициент 0,9 и пересчитывают на 100 г дрожжей.

П р и м е р. Вес (в г) равен:

тигля с навеской дрожжей.................. 18,3100

тигля прокаленного пустого .............. 15,5421

навески дрожжей..................................... 2,7683

тигля с золой............................................ 15,7436

золы.............................................................. 0,2015

Вес углекислой золы (в г) составит 0,2015 · 0,9 = 0,18135.

Содержание золы (в %) равно

20.4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ГЛУТАТИОНА

Метод основан на том, что в кислой среде в при­сутствии йодистого калия восстановленная форма глутатиона под действием КJО₃ переходит в окисленную.

Глутатион в восстановленной форме содержит сульфгидрильную группу (SН) и является активатором протеолиза; в сахаромицетах его 0,6–0,8, что в 4–5 раз больше, чем в несахаромицетах – 0,15–0,1. Поэтому содержание глутатиона может служить относи­тельным показателем степени загрязненности прессованных дрожжей посторон­ними дрожжевыми грибами. Но, что не менее важно, ме­тод может быть использован как косвенный показатель функциональной полноценности клеточной стенки.

Определение глутатиона – йодредуцирующих ве­ществ – производят с помощью йодноватокислого калия и выражают в мл 0,001 Н раствора КJО₃, пошедшего на титро­вание 1 г прессованных дрожжей.

Ход определения. 10 г исследуемых дрожжей помеща­ют в колбу, постепенно при­ливают 95 см³ дистиллирован­ной воды и размешивают; через 5 мин добавляют 5 см³ молярного раствора сульфосалициловой кислоты (25 г на 100 см³ дистиллированной воды). Смесь тщательно встря­хивают, фильтруют через сухой обеззоленный фильтр и из фильтрата берут 10 см³ в небольшую колбу. В ту же кол­бу добавляют 2,5 см³ 4%-ной сульфосалициловой кисло­ты, 2,5 см³ 5%-ного раствора химически чистого КJ (при­готовляемого ежедневно и проверенного на отсутствие сле­дов йода), 10 капель 1%-ного раствора крахмала (в воде или лучше в насыщенном растворе КСl или NaCl), осто­рожно оттитровывают из микробюретки 0,001 Н раство­ром КJО₃ до первого изменения окраски.

Титрование производят при температуре растворов, не превышающей 20°С. Таким же путем ставят и контроль­ное определение, заменяя только испытуемый раствор 10 см³ дистиллированной воды и вычитая полученные цифры из результатов основного опыта. Полученные ре­зультаты выражают в см³ 0,001 Н КJО₃ на 1 г прессован­ных дрожжей.

Общий запас восстановленного глутатиона определя­ют после 5-минутного кипячения дрожжей с водой с при­менением той же методики.

Растворы для определения глутатиона.

1. Молярный раствор сульфосалициловой кислоты. 25 г на 100 см³ дистиллированной воды.
2. 24%-ный раствор сульфосалициловой кислоты. 18 см³ молярного раствора разбав­ляют до 100 см³ дистил­лированной водой.
3. 0,001 Н раствор йодноватокислого калия. 0,1783 г перекристаллизованного химически чистого КJО₃ рас­творяют в мерной колбе на 1 дм³, откуда берут 20 см³ рас­твора, прибавляют 9 см³ молярного раствора сульфоса­лициловой кислоты и доводят дистиллированной водой до 100 см³ в мерной колбе. Этот разбавленный раствор КJО₃ следует приготовлять каждую пятидневку и хранить при пониженной температуре. 8,5 г КJО₃ растворяют в 100 см³ дистиллированной воды, содержимое фильтруют. Для кри­сталлизации соли фильтрат помещают в холодильник на ночь, осадок отфильтровывают и высушивают между лис­тами фильтровальной бумаги. Полученную соль хранят в темной стеклянной банке с притертой пробкой.