При микробиологическом изучении количественного состава микрофлоры предполагают, что то малое количество материала, которое обычно используется в анализах, должно обеспечивать достаточно точную микробиологическую характеристику всего объекта. С этой целью отбирается средняя проба.
Отбор проб для анализа, предполагающего микробиологические исследования, ведется в целом по принципу обычного отбора средней пробы. Однако выполняется он стерильно, с соблюдением правил асептики. Весь инвентарь предварительно стерилизуют. Чтобы избежать размножения микрофлоры, анализ проводят сразу после ее отбора. Необходимо учитывать возможность очень неравномерного распределения микрофлоры в пищевых продуктах и других объектах. Так, в отстоявшемся свежем молоке основная масса микроорганизмов сосредоточивается в верхнем слое. В вареных колбасах, взятых из магазина, следует ожидать большего числа микроорганизмов на оболочке и во внешнем слое и меньшего — в центральной части батона.
При анализе воды, отбираемой из крана, надо учитывать возможность накопления микрофлоры в трубах вблизи крана. Чтобы получить правильные результаты, следует некоторую часть воды слить, а анализу подвергнуть следующие порции.
Для плодов и овощей, у которых микрофлора сосредоточена на поверхности, удобно пользоваться смывами. Плоды помещают в заранее простерилизованный сосуд и в него же вливают определенное количество стерильной воды. После энергичного встряхивания в течение нескольких минут микроорганизмы оказываются смытыми в воду и она может использоваться для посевов.
При исследовании спецодежды и полотенец, прилавков, котлов и т. д. целесообразно воспользоваться трафаретом из проволоки с внутренней площадкой в 25 или 50 см2. Трафарет стерилизуют в пламени горелки, прикладывают к исследуемой поверхности ограниченную им площадку трехкратно обмывают стерильными ватными тампонами, смоченными в колбе со 100 мл стерильной воды. Обрабатывают четыре площадки в разных местах объекта, с тем чтобы усреднить конечные результаты исследования. Все 12 тампонов собирают в пустую стерильную колбу и в нее выливают остатки воды, в которой их смывали. После встряхивания и десорбции микрофлоры с тампонов в воду ее подвергают исследованию.
Результаты анализа обычно относят к 1 г вещества, 1 мл жидкости, 100 см2 поверхности. Особенности анализа других объектов будут отмечены далее.
При выполнении работы необходимо строго учитывать количество материала, взятого для исследования, готовить разведения в точно отмеренном количестве воды и учитывать степень разведения при окончательном подсчете. Для практического освоения методов микробиологического анализа каждая работающая группа из 2-4 человек должна самостоятельно выполнить посевы из заранее приготовленных образцов (1 г или 1 мл пищевого продукта в колбе со 100 мл воды). Могут быть исследованы воздух, поверхности рабочих столов, прилавка.
Из колбы после тщательного, но осторожного взбалтывания (чтобы не замочить ватную пробку) стерильной бактериологической пипеткой отбирают 1 мл жидкости и вносят в первую чашку Петри. Той же пипеткой еще 1 мл переносят во вторую колбу со 100 мл стерильной воды. После взбалтывания этой колбы для равномерного распределения внесенного материала в воде из нее новой пипеткой отбирают 1 мл жидкости и вносят во вторую чашку Петри и затем второй же пипеткой — 1 мл в третью колбу. Из нее после взбалтывания новой пипеткой отбирают 1 мл и вносят в третью чашку Петри.
Таким приемом получают разведения материала в 100, 10000 и 1 000000 раз. В случае если предполагается меньшее обсеменение материала, то вместо колб можно использовать пробирки с 10 мл стерильной воды. Это позволит получить разведения, отличающиеся концентрацией материала и находившихся в нем микроорганизмов не в 100, а лишь в 10 раз. После разливки материала сразу же необходимо в каждую чашку Петри внести теплый (около 45-50 °С) расплавленный МПА из заранее подготовленных пробирок. Более горячий агар использовать не следует, так как он вызовет гибель части микроорганизмов, что исказит конечные результаты анализа. Агар с меньшей температурой также непригоден, так как быстро застывает.
Внесенная проба смешивается с питательной средой (МПА) осторожным покачиванием и легким вращением закрытой чашки. Все чашки для застывания среды оставляют на горизонтальной поверхности на 2-3 мин. После нанесения этикеток чашки, перевернутые вверх дном, помещают в термостат для выращивания, которое ведут при температуре 37 °С в течение 24 ч или при 22 °С в течение 48 ч.
При определении общего количества микроорганизмов в воздухе удобно воспользоваться методом оседания по Коху (седиментационный метод). Чашки Петри, с мясопептонным агаром или суслом-агаром (последний для учета грибов) оставляют открытыми на 5-10 мин, а если воздух чистый,— в течение получаса. Ставят их на разном расстоянии от пола и в разных местах. Вместе с пылью и капельками влаги на поверхность агара оседают и микробы. По истечении установленного времени чашки закрывают крышками, ставят их вверх дном и выдерживают при температуре 22 °С в течение 5 дней или при 40°С в течение 48 ч (для выращивания грибов — в течение 5-7 дней). Допуская, что каждая колония выросла из одной микробной клетки, подсчитывают число бактерий в воздухе. На поверхность чашки площадью 100 см2в течение 5 мин оседает примерно столько микробов, сколько их содержится в 10 л воздуха.
Пользуясь этим методом, можно получить только приблизительное представление о содержании микробов, в воздухе, так как он не учитывает скорости движения воздуха и других факторов. Если в среднем на одной чашке Петри выросло до 200 колоний, то воздух считается чистым, свыше 200 — загрязненным. Пересчет количества микроорганизмов в исследуемом воздухе, полученного чашечным методом, не рекомендуется производить на количество микроорганизмов, содержащихся в единице объема воздуха, так как данные пересчета могут расходиться с действительным количеством микробов воздуха.
Подобным же образом можно исследовать микрофлору рук. Для этого левую или правую руку (ладони, пальцы, межпальцевые и подногтевые пространства) протирают стерильными ватными тампонами. Полученный смыв высевается на МПА в разведении 1/100 или 1/10000.
Бактериоскопический метод подсчета (метод отпечатков) применяется для оценки свежести мяса, однако может быть использован и для ориентировочной оценки количественного и качественного состава микрофлоры других продуктов — рыбы, полуфабрикатов. Для оценки свежести мяса из пробы готовят три мазка-отпечатка: один — из поверхностного слоя с глубины 1-2 мм, другой — с глубины 2-2,5 см и третий — с глубины 3-3,5 см.
При изготовлении препарата-отпечатка из поверхностного слоя мяса стерильными ножницами вырезают кусочек 0,5-1 г и срезанной стороной прижимают для получения отпечатка и поверхности профламбированного и охлажденного предметного стекла. Чтобы приготовить препарат-отпечаток из глубоких слоев, поверхность мяса сначала прижигают нагретым шпателем, затем стерильным скальпелем производят глубокий разрез, пинцетом раздвигают края, вырезают кусочек мяса и, прижимая к .поверхности предметного стекла, делают отпечаток.
Мазки сушат на воздухе, фиксируют в пламени спиртовки, окрашивают по Граму и микроскопируют (можно окрашивать и обычным методом).
Окраска по Граму используется для оценки возможного присутствия, бактерий коли-тифозной группы, все представители которой грамотрицательны.
Просматривают не менее пяти полей зрения. В каждом подсчитывают отдельно кокковые и палочкообразные клетки, а затем вычисляют их среднеарифметическое количество в одном поле зрения.
В соответствии с действующим на мясо ГОСТом результаты испытаний оцениваются следующим образом: мясо свежее, мясо сомнительной свежести и мясо несвежее.
Мясо свежее. В поле зрения в мазках-отпечатках, приготовленных из поверхностного слоя, обнаруживается небольшое количество микробов (единичные кокки и палочки), окрашенных грамположительно. В мазках из глубоких слоев микробы совсем не обнаруживаются или встречаются единичные клетки. На стекле нет следов распавшейся ткани мяса.
Мясо сомнительной свежести. В поле зрения в мазках, приготовленных из поверхностного слоя, обнаруживается несколько десятков микробов: в мазках из глубинных слоев — не более 20-30 бактерий с преобладанием кокковых форм. Заметны следы распада мышечной ткани.
Мясо несвежее. В мазках-отпечатках, приготовленных как из поверхностных, так и из глубинных слоев, почти вся площадь поля зрения покрыта клетками микробов, среди которых преобладают грамотрииательные палочки. В таком мясе кокки почти отсутствуют. В поле зрения в большом количестве обнаруживаются палочки и распавшаяся мышечная ткань.
