Рост микроскопических грибов (дрожжей и плесеней) в молочных продуктах происходит медленнее, чем бактерий, но их способность утилизировать самые разные субстраты и выживать в гораздо более жестких условиях делают их потенциально еще более опасными причинами порчи. С этой точки зрения наиболее важными являются классы зигомицетовых и аскомицетовых грибов в телеоморфной и анаморфной формах. Наиболее важные факторы, влияющие на развитие грибов в продуктах, - состав и концентрация доступных питательных веществ, рН, активность воды и температура, причем важно учитывать взаимодействие между этими факторами.

Развиваясь в молочных продуктах, плесени портят товарный вид продукта. Обладая липолитическими и протеолитическими свойствами, они вызывают гидролиз молочного жира (прогоркание) и разложение белков (гнилостный запах, горький вкус). Плесени для своего роста нуждаются в кислороде, а для споруляции - в газообразной фазе. Споры плесеней в больших количествах находятся в воздухе, почве, на поверхности оборудования, стен, потолков и т. д. Плесени очень устойчивы к низким температурам, многие виды являются психрофилами, некоторые развиваются в холодильниках даже при минусовой температуре. Наиболее часто на молочных продуктах развиваются плесени:

• Geothrichum lactis (старое название Oidium lactis - молочная плесень);
• Penicillium notatum, P. commune, P. roqueforti, P. chysogenum, P. expan- sum, P. solitum;
• Aspergillus niger, A.flavus, A. fumigates, A. nidulans;
• представители родов Mucor, Alternaria, Catenularia, Cladosporium.

Традиционные методы предупреждения пороков, связанных с развитием

плесеней, основаны на соблюдении технологических режимов тепловой обработки и хранения полуфабрикатов и продуктов, правил мойки и дезинфекции, контроле и очистке воздуха, добавлении противогрибковых препаратов - сорбата и пропионата, использовании герметичной упаковки. В работе А. В. Молдавановой (руководитель - В. И. Ганина) установлено, что штаммы пробиотических бактерий Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus fermentum и Lactobacillus rhamnosus оказывают ингибирующее действие на плесневые грибы рода Penicillium, которые являются наиболее распространенными возбудителями порчи мягких и полутвёрдых сыров. Показано, что разные виды бактерий-пробиотиков отличались по ингибирующему биопотенциалу в отношении изученных видов плесневых грибов (табл. 3.2).

Таблица 3.2

Антагонистическая активность некоторых пробиотиков по отношению
к плесневым грибам рода Penicillium

Самым очевидным признаком дрожжевой порчи пищевых продуктов является вздутие упаковки под действием выделяемого углекислого газа, образующегося в результате медленного сбраживания Сахаров. Выделение С0₂ может быть достаточным для деформации и даже взрыва продукта или его упаковки. Эти процессы могут сопровождаться появлением неприятного запаха, посторонних привкусов и мути. В молочных продуктах дрожжи могут вызывать следующие процессы и пороки:

• образуют СО₂, вызывая порок вспучивания в кисломолочных напитках, твороге, сметане, бомбаж сгущенного молока с сахаром, пороки консистенции и рисунка сыров;
• образуют этиловый спирт и создают условия для развития уксуснокислых бактерий, вызывают пороки «спиртовые вкус и запах», способствуют формированию уксусного привкуса и запаха;
• образуют продукты метаболизма, комплекс которых формирует «дрожжевой привкус» молочных продуктов;
• обладают липолитической ц протеолитической активностью, вызывают прогоркание, осаливание, появление неприятного запаха и горького вкуса, слизь на поверхности творога, сметаны, масла, сыров;
• некоторые виды дрожжей (преимущественно рода Rhodotorula) могут образовывать красные, розовые, желтые колонии (пятна) на молочных продуктах.

Причиной порчи молочных продуктов обычно становятся представители родов Saccharomyces, Candida, Kluyveromyces, Geotrichum, Torulopsis, Rhodoto- rula, Pichia, Debaromyces, Sporobolomyces. Следует обратить внимание, что мнение микологов о представителях рода Geotrichum (ранее - Oidium), к которому относится хорошо известная «молочная плесень» Geotrichum lactis, разделилось: одни считают их дрожжами, другие по-прежнему относят к плесеням. Морфология клеток Geotrichum lactis показана на рисунке 3.3.

Рис. 3.3
Морфология клеток Geotrichum lactis (расплав кефирного грибка, зараженного молочной плесенью, фиксированный препарат, окраска метиленовым синим, увеличение 90x15)

Учитывая то, что таксономия дрожжей постоянно меняется, возбудителей порчи можно условно разделить на «культурные» и «дикие». Источником микроорганизмов первой группы служат закваски, поэтому на предприятиях необходимо предусматривать отделение заквасочных для кефира и других кисломолочных продуктов смешанного брожения от заквасочных для других продуктов, желательно также разделять и участки их производства. «Дикие» дрожжи чаще всего попадают из воздуха и различных наполнителей, особенно фруктово-ягодных и сахара. В связи с этим на предприятиях должен проводиться регулярный контроль микробиологических показателей воздуха и всех применяемых пищевых добавок. К общепринятым в нашей промышленности мерам предупреждения пороков молочных продуктов относятся также: соблюдение правил мойки и дезинфекции; контроль режимов тепловой обработки и температурных режимов хранения продуктов.

Для предупреждения дрожжевой порчи продуктов могут быть использованы и другие меры:

• внедрение систем НАССР, GMP и С1Р-мойки;
• использование микрофильтрации;
• применение антибиотиков, например, натамицина из Streptomycetes;
• внесение фунгицидных средств и консервантов, причем обычно применяющиеся в пищевой промышленности сорбиновая, бензойная, уксусная и пропионовая кислоты часто не предотвращают дрожжевую порчу даже в максимально допустимой концентрации; имеются данные об успешном применении эфирных масел и ванилина;
• термизация готового продукта;
• «ультрачистый» розлив продуктов;
• упаковка в модифицированной газовой среде;
• введение в продукт СОг;
• применение сверхвысоких давлений;
• обработка электрическим током высокой интенсивности;
• сочетание различных воздействий.

Такой перечень способов подавления дрожжей свидетельствует о том, что эти микроорганизмы трудно поддаются воздействию и проблема борьбы с дрожжевой порчей продуктов до сих пор остается актуальной.

Нормирование количества дрожжей как микроорганизмов порчи предусмотрено Техническим регламентом Таможенного союза 033/213 «О безопасности молока и молочной продукции». Данные о нормативах в обобщенном виде приведены ниже.

Продукты, в которых допускается не более 50 КОЕ/г дрожжей:

• кисломолочные продукты со сроками годности более 72 ч;
• термически обработанные сквашенные продукты;
• творог, творожные продукты со сроками годности менее 72 ч;
• сыворотка молочная, кисломолочные продукты, пахта, ЗЦМ сухие;
• сахар молочный, концентрат лактулозы.

Продукты, в которых допускается не более 100 КОЕ/г дрожжей:

• сметана, продукты на ее основе;
• масса из альбумина, продукты на ее основе;
• творог, творожные продукты с компонентами и сроками годности более 72 ч;
• сыры плавленые с компонентами;
• масло сливочное с компонентами, спреды, топленая смесь.

Продукты, в которых дрожжи и плесени нормируются в сумме (КОЕ/г):

• термически обработанные творожные продукты - не более 50;
• масло сливочное - не более 100;
• закваски жидкие и сухие - не более 5.

Для количественного определения дрожжей в микробиологии традиционно используются следующие методы:

• прямой подсчет клеток под микроскопом в камерах Горяева, причем существуют методы окраски, позволяющие выявлять живые и мертвые клетки; для получения достоверных результатов необходимо просмотреть до 100 полей зрения, что требует длительной и кропотливой работы микробиолога;
• спектрофотометрический метод; основан на измерении оптической плотности (мутности) образца, дает точные результаты только на прозрачных питательных средах;
• метод высева образца или его разведения на плотные питательные среды, с последующим их термостатированием и подсчетом выросших колоний; является основой стандартных методов определения дрожжей (и плесеней).
• В производственных лабораториях предприятий молочной промышленности микробиологические анализы для выявления микроорганизмов порчи выполняются в соответствии со следующими стандартами:
• ГОСТ 33566-2015 «Молоко и молочные продукты. Определение дрожжей и плесневых грибов»;
• ГОСТ 10444.12-2013 «Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Методы выявления и подсчёта количества дрожжей и плесневых грибов»;
• ГОСТ 30706-2000 «Продукты молочные для детей. Метод определения количества дрожжей и плесневых грибов»;
• ГОСТ ISO 6611-2013 «Молоко и молочные продукты. Подсчет коло- ниеобразующих единиц дрожжей и/или плесневых грибов. Методика определения количества колоний при температуре 25°С»;
• ГОСТ 28805-90 «Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества осмотолерантных дрожжей и плесневых грибов»;
• с применением пластин PETRIFILM;
• MP «Метод выявления дрожжей и плесневых грибов в пищевых продуктах», 2004 г. (при внутреннем контроле).

Обобщение опыта работы учебных и производственных лабораторий позволяет говорить о следующих проблемах, которые возникают при определении дрожжей по стандартным методикам:

• предусмотрено использование разных видов сред: в основном плотных Сабуро и БФ, допускается также использование жидкой среды - солодового сусла; имеется уточнение, что именно среда БФ предназначена для анализа молочных продуктов, но в лабораториях часто используют среду Сабуро, так как запрета на ее применение нет;
• рост дрожжей существенно зависит от рН среды, в то же время агар Сабуро должен иметь в готовом виде рН 6,5±0,1; среда БФ 4,2±0,2; солодовое сусло (при большой обсемененности продукта) подкисляют до 3,6±0,1; вследствие этого результаты количественного определения дрожжей на разных средах могут значительно отличаться;
• вызывает сложности сам процесс доведения рН сред до нужного значения, так как значение этого показателя нормируется в готовом агаре при 25°С, однако при такой температуре среда уже застывает и точно измерить ее рН практически невозможно; кроме того, после снижения рН среды часто не застывают, что требует дополнительного введения агара;
• результаты зависят добавления антибиотика, причем в стандарте предлагается использовать один из 13 видов антибиотиков разных групп (стрептомициновые, левомицетиновые, пенициллиновые и др.), действие которых на разные группы микроорганизмов, по-видимому, может отличаться;
• проведение анализа Требует много времени, так как термостатирова- ние проводится в течение 3 (предварительная оценка), § (окончательная оценка) и даже 7 дней (для осмотолерантных дрожжей);
• согласно ГОСТ, рост дрожжей на агаризованных средах сопровождается образованием крупных, выпуклых, блестящих, серовато-белых колоний с гладкой поверхностью и ровным краем, т. е. дано описание поверхностных колоний, подлежащих подсчету; в то же время при выполнении анализа проводится глубинный посев, и в этом случае дрожжи как факультативные анаэробы могут также давать рост в глубине среды; кроме того, цвет колоний дрожжей может быть розовым, желтым, коричневатым и т. д., а край колоний не всегда бывает ровным;
• не обнаруживаются клетки с сублетальными повреждениями, не растущие на средах, но способные восстанавливаться и вызывать порчу продуктов;
• нет возможности дифференциации видов.

В последние годы стали появляться новые методы количественного определения микроорганизмов, которые позволяют провести анализ быстрее. К ним можно отнести методы, основанные на измерении электропроводности питательной среды или АТФ-биолюминесценпии, применении Петри-фильмов, измерении градиента денатурации при гель-электрофорезе (DGGE), проведении ПЦР-анализа фрагментов ДНК в режиме реального времени, однако для большинства предприятий они пока не доступны из-за высокой стоимости. В этом плане представляет интерес применение отечественных микробитестов для определения дрожжей и плесеней. К современным методам исследований в пищевой промышленности также относится провокационное тестирование для определения стабильности свойств и срока годности продукта. Прогностические модели микробиологической порчи пищевых продуктов для дрожжей предусматривают следующие условия: температура 0-22°С; рН 2,6-6,0; концентрация сахара 0-50%; концентрация соли 0,5-10%.