§1. Основные положения

Во все времена пища человека содержала вещества, которые в определённых условиях и при достаточной концентрации представляли опасность для жизни или здоровья. Это могли быть естественные составляющие продуктов питания, например ядовитые вещества из рапса7 и других кормовых культур, вызываю­щие увеличение щитовидной железы, или цианогенные гликозиды из маниоки. Кроме того, опасные и вредные вещества могут образовываться как реакция рас­тений на внешние патогенные факторы (так называемые фитоалексины; напри­мер, соланин или хаконин в картофеле) или в результате микробиологического поражения продуктов питания (микотоксины и др.). Из-за высокой ядовитости большинства микотоксинов этот вид заражения представляет собой серьёзную проблему. Поскольку целенаправленное и квалифицированное примене­ние консервирующих веществ может препятствовать образованию микотокси­нов, консерванты вносят существенный вклад в безопасность нашего питания.

Ранее вспомогательные вещества и пищевые добавки (в том числе консер­ванты) применяли в продуктах питания без особой проверки. Достаточным до­казательством их безвредности считалось отсутствие непосредственных негатив­ных последствий для здоровья при употреблении пищевых продуктов с этими добавками. Таким способом человечество «тестировало» вещества, добавляемые в пищу (как, впрочем, и самое пищу).

Со времен бесконтрольного использования «химикалий» в консервирова­нии пищевых продуктов берет свое начало заметная ещё и сегодня (хотя уже уменьшающаяся) неприязнь многих людей к пищевым консервантам вообще. В XX веке (особенно с 50-х годов), в связи с развитием такой науки, как токсико­логия, положение принципиально изменилось. Вспомогательные вещества и пи­щевые добавки разрешаются к использованию в продуктах питания только в том случае, если их токсикологические испытания (проведенные в соответствии с современными научными требованиями) не дают оснований предполагать нали­чие какого-либо вреда от них. Законодательство о пищевых добавках исходит из принципа «запрета с разрешающей оговоркой». Изначально все пищевые добав­ки запрещены; применяться могут только те из них, для которых чётко оговари­ваются предельное количество и область применения. Сегодня токсичность вспо­могательных веществ и пищевых добавок изучена лучше, чем токсичность мно­гих продуктов питания и их компонентов. Это связано с тем, что к природным ядовитым составляющим пищевых продуктов общественность всегда проявляла несравнимо меньший интерес, чем к пищевым добавкам.

При токсикологической оценке вспомогательных веществ и пищевых добавок исходит из того, что между дозировкой и продолжительностью действия, с одной стороны, и наблюдаемыми последствиями, с другой, имеется причинно-следственная связь, которая может быть выражена математически (зависимость доза-действие), и что существует некоторая доза, ниже которой вещество не ока­зывает влияния на организм (допустимая доза, пороговое значение). Эта доза должна быть определена. Причём следует констатировать не факт проявлении действия, как обычно делается в фармакологии, а факт его отсутствии – непри­вычная для научной теории и практики задача. Сказанное о допустимой дозе не относится к канцерогенным и генотоксичным веществам, так как для такого ро­да веществ пороговое значение не может быть определено по причине их особенно широкою биологического действия8 (ковалентные модификации ДНК).

Еще Парацельс в 1538 году в третьем из семи своих основополагающих определений (Epístola dedicorata St. Veit) следующим образом сформулировал тот принцип, что нужно принимать малые дозы веществ, чтобы они не оказывали острого ядовитого действия: «Все содержит яд, / и все есть яд, / и ничего нет без яда, / только доза делает / вещь чистым ядом. / Например, любая еда / и любое питье, / принимаемые не в своей дозе, / становится ядом, / что приводит к выводу: / это я сам позволяю / яду быть ядом».

Парацельс хотел этим сказать не только то, что любое вещество становится ядом, начиная с определённой дозы, но и что существуют дозы, ниже которых отсутствует токсическое действие яда.

Требуемый объём исследований и методы их проведения определяются имею­щейся или предполагаемой потребностью в проверяемом веществе. В экспери­ментах с животными сегодня существует целый ряд экспресс-методов in vltro, в которых могут быть исследованы такие параметры, как генная токсичность и му­тагенность (см. §4 и 5 гл. 3). «Раздражающее действие» и «проникновение через кожу» также изучаются в тестах in vitro (например, «хорионаллантоидный» тест). Подобным образом изучается и острая генная токсичность (например. Neutral Red uptake inhibition test). Однако все известные тесты in vitro, даже в совокупно­сти, не могут полностью заменить испытания на животных. Тестирование in vitro позволяет лишь уменьшить число таких испытаний. Кроме того, в каждом отдельном случае необходимо решать вопрос правомерности переноса результа­тов, полученных in vitro, сначала на животных, а потом и на человека.

Основные сведении для токсикологической оценки получают в эксперимен­тах in vivo. Предпочтительно использование мелких животных с коротким вре­менем жизни – мышей, крыс и других грызунов, собак, обезьян; в отдельных случаях используют иные виды животных. Всех их специально разводят и содер­жат в определенных условиях. Для решения некоторых фармакологических за­дач подопытных животных разводят методами генной инженерии, которые дают отличные модели для экспериментов.

На следующем этапе биохимическое поведение вещества и его обмен у че­ловека исследуются под врачебным контролем на добровольцах (как и при изу­чении лекарств). Вследствие этого риск перенесения на человека результатов, которые получены в экспериментах с животными, сильно уменьшается.

В настоящее время для оценки безопасности вспомогательных веществ и пи­щевых добавок в качестве главных рассматриваются следующие критерии.

-    острая токсичность;

-    метаболизм и токсикокинетика;

-    генотоксичность/мутагенность;

-    репродуктивная токсичность, включая тератогенность и влияние на способность к воспроизведению потомства;

-    субхроническая токсичность;

-    хроническая токсичность;

-    канцерогенность.

Последовательность оценки токсикологической безопасности вспомогатель­ных веществ и пищевых добавок представлена схемой на рис. 1. Отдельные ис­следования часто проводят одновременно; например, опыты по хронической ток­сичности сочетают с проверкой на канцерогенность. В исследованиях по обмену веществ определяют, происходит ли накопление проверяемого вещества в орга­низме. Проверяют также, происходят ли биопревращення испытуемого вещест­ва (всасывание, распространение, метаболизм и удаление).

Рис. 1 (с. 21)

Применение современных методов токсиколого-гигиенических исследова­ний в институтах, специализирующихся в соответствующей области, даёт уве­ренность, что используются подходящие виды животных при надлежащем их со­держании и кормлении, а также правильно выбираются способ введения прове­ряемых веществ и их дозы. Соответствующие рекомендации имеются, например, в документах Организации экономического сотрудничества и развития – ОЭСР (Organization for Economic Cooperation and Development – OECD). И наконец, решающим является правильная интерпретация результатов.

Перед началом токсикологических исследований вещества требуется устано­вить его идентичность, т.е. проверяемое вещество должно быть химически и физи­чески идентично тому, которое в дальнейшем будет использоваться на практике. Поэтому сначала устанавливают точные характеристики проверяемого вещества. Наряду с обычными химическими показателями они должны включать содержа­ние основного вещества и допустимое содержание примесей. Для синтетического соединения или однокомпонентного природного вещества установление характе­ристик, как правило, проще, чем для многокомпонентных природных веществ. Для первых известен путь синтеза, есть указания на возможность наличия побоч­ных продуктов, которые обычно удаляют из испытуемого вещества с помощью очи­стки (перекристаллизации, перегонки и пр.). Поскольку сами вспомогательные вещества и добавки применяются впищевых продуктах в малых количествах, то примеси к ним (содержание которых составляет миллиграммы или даже микрограммы на 1 кг) попадают в пищевой продукт еще более разбавленными.

Желательно, чтобы пищевые добавки не проявляли фармакологического дей­ствия. Это требование предъявляется и к консервантам. Казалось бы, для них оно особенно актуально, так как, обладая антимикробной активностью, консер­ванты, в принципе, могут применяться против возбудителей болезней (напри­мер, дерматомикозов). Реально фармакологическая эффективность веществ, ис­пользуемых в качестве пищевых консервантов, мала и её можно не учитывать. Вещества, находящие практическое применение в медицине (например, некото­рые антибиотики), не используются в качестве пищевых добавок из-за опасно­сти привыкания к ним.

§2. Острая токсичность

Показатель острой токсичности – средняя летальная доза (LD50) дает гру­бую оценку токсикологических свойств вещества при одноразовом приёме. Она представляет собой дозу, при которой погибает (предположительно) 50% подопытных животных, и зависит от многих факторов – вида животных, их воз­раста, массы, пола и условий содержания. Для того чтобы можно было сравни­вать показатели острой токсичности различных веществ, все эти факторы долж­ны быть стандартными.

Показатель острой токсичности указывают в миллиграммах проверяемого вещества на 1 кг массы тела подопытного животного. Чем выше значение LD50, тем меньше острая токсичность вещества.

Для газообразных веществ показателем острой токсичности служит средняя летальная концентрация (LC50) измеряемая в миллиграммах на 1 л воздуха. От показателей LD50 и LC50 следует отличать среднюю эффективную дозу (ЕD50) – дозу, которая оказывает определенное действие на 50% животных.

Для определения LD50испытуемое вещество в различных дозах дают груп­пам животных, состоящим из 5 мужских и 5 женских особей. Вспомогательные вещества и пищевые добавки вводят только перорально. Исследуемая доза вво­дится единовременно с помощью зонда; если она слишком велика (например, при очень малой токсичности), её можно давать частями, но в течение одного дня. Животные наблюдаются не менее 1-2 недель.

Показатель острой токсичности прежде всего даёт информацию, необходи­мую для определения места испытуемого вещества в ряду известных соедине­ний. Кроме того, в испытаниях на острую токсичность получают сведения о ха­рактере токсикологического действия – при вскрытии трупов животных в от­дельных случаях можно установить, какие органы особенно подвержены дейст­вию тестируемого вещества. Эти наблюдения служат отправной точкой для даль­нейших токсикологических исследований, в частности LD50 даёт ориентиры для определения диапазонов дозировок в тестах на субхроническую и хроническую токсичность. И наконец, определение острой токсичности позволяет получить информацию об ожидаемом риске для человека в случае аварии, злоупотребле­ния или профессиональной работы с данным веществом.

В зависимости от значения средней летальной дозы вещество можно отнести к одному из следующих классов:

Данные, приведённые в табл. 2, показывают, что вещества, применяемые в качестве консервантов, относятся к 4-му и 5-му классам токсичности. Исключе­ние составляют нитриты (3-й класс токсичности).

В соответствии с постановлением ОЭСР №401 (проверка острой токсично­сти) описанные выше опыты для определения острой токсичности с 1991 года по научным и этическим соображениям заменены значительно более прогрессив­ной (с точки зрения защиты животных) процедурой «Fixed-dose-procedure».

§3. Исследование метаболизма и токсикокинетики

Сведения о всасывании и возможных превращениях испытываемого веще­ства в организме имеют ни его обшей токсикологической оценки такое же зна­чение, как и данные об органах, подверженных его воздействию. Опыты сначала тоже проводятся на животных.

Таблица 2. Средняя летальная доза некоторых веществ, проявляющих консервирующее действие 

Особо важны исследования на животных, которые метаболизируют тести­руемое вещество подобно человеку, так как на следующем этапе к опытам при­влекают добровольцев (под врачебным контролем).

В предварительных опытах на животных формируются общие представле­нии о вероятном поведении тестируемого вещества в организме, in vitro проверя­ется его устойчивость к кислотному, щелочному и ферментативному гидролизу, действие на изолированные органы, клетки и одноклеточные организмы.

Чтобы проследить путь вещества в организме, его вводят в нормальной и повышенной концентрациях и изучают превращение и выделение самого веще­ства и метаболитов в биологических жидкостях, органах и тканях. С помощью повышенных доз выясняют зависимость метаболизма от дозировки (появление иных метаболитов при «перегрузке» обычных путей превращения). Устанавли­вают, в каком органе или ткани происходят биохимические превращения иссле­дуемого вещества и как они зависят от дозы и времени. Иногда подопытным животным вводят исследуемое вещество, «меченное» радиоактивным изотопом углерода 14С.

Если наблюдается распад молекулы на несколько частей, то можно исполь­зовать соединения, «меченные» двумя изотопами (например, 3Н и 14С), и обна­руживать их в органах и биологических жидкостях животного по отдельности. Общее распределение радиоактивности в организме подопытного животного ис­следуется с помощью авторадиографии. Для этого животное (мышь или крысу) после введения исследуемого вещества умерщвляют и подвергают глубокому за­мораживанию в жидком азоте. Гистологические срезы радиофотографируют. По­лученные изображения позволяют визуально наблюдать распределение общей радиоактивности в организме животного.

При авторадиографии нельзя различить исходное вещество и метаболиты. Это можно сделать для каждого отдельного органа, подвергнув его ткани экс­тракции и разделив экстракт методом ВЭЖХ с детектором по радиоактивности. Для выяснения структуры метаболитов используются УФ- и ИК-спектроскопия, ЯМР-спектроскопия на ядрах 1Н и 11С и масс-спектрометрия. Исследования ме­таболизма составляют основу для дальнейших опытов по изучению субхрониче­ской и хронической токсичности.

Существует несколько вариантов участия консерванта в обмене веществ. Не­растворимые вещества, как правило, проходят неизменёнными через кишечник, и в этом случае на биологическое воздействие вне желудочно-кишечного тракта или появление метаболитов рассчитывать не приходится. Предварительно долж­но быть точно установлено, что исследуемое вещество не подвергается измене­ниям под действием кишечных бактерий и не всасывается в виде продуктов рас­пада. Иногда у весьма мелкодисперсных веществ появляется возможность пря­мого перехода из кишечника в кровеносную систему в результате пиноцитоза или фагоцитоза. Соединений, относящихся к первой группе, среди консерван­тов нет.

Вторая группа веществ хотя и всасывается из желудочно-кишечного тракта, но химическому превращению не подвергается. Они не дают токсичных метабо­литов и могут неизменёнными выводиться с мочой. При испытании таких ве­ществ необходимо проверять, не происходит ли их превращение под действием кишечной микрофлоры. Среди этой группы консерванты также отсутствуют.

Вещества третьей группы всасываются из желудочно-кишечного тракта, но после биохимического разложении или превращения (биотрансформации) вы­водятся из организма. На первом этапе они, например, окисляются, а затем, на втором этапе, приобретают гидрофильность (связываясь с глюкуроновой, сер­ной, фосфорной кислотами или иным путём), а вместе с нею и способность к выведению из организма. Для веществ, метаболизирующихся подобным обра­зом, характерны достаточно быстрые биохимические превращения и отсутствие накопления метаболитов в организме. Примером может служить бензойная ки­слота, которая в организме человека образует с глицином гиппуровую кислоту и в таком виде выводится с мочой10.

Четвёртую группу образуют соединения, которые всасываются и метаболизируются подобно веществам третьей группы, но их выведение или выведение их метаболитов происходит относительно медленно. Такие вещества могут нака­пливаться в организме, что нежелательно. Примеры консервантов этого вида – борная и салициловая кислоты.

Последнюю группу составляют соединения, которые организм после всасы­вания использует также, как обычные питательные вещества Они подвергаются биохимическому разложению, подобно компонентам пищи – жирам, белкам, углеводам и пр. Примерами веществ такого рода являются пропионовая и сорбиновая кислоты.

§4. Генотоксичность

Под генетической токсичностью (генотоксичностью, мутагенностью) веще­ства понимают его способность оказывать вредное воздействие на наследствен­ность, т.е. вызывать нежелательные мутации. Спонтанно мутации происходят у любого живого организма, но они быстро исправляются определённой «ремонт­ной» системой. Мутации, вызываемые генотоксикантами, возникают в результа­те связывания последних с ДНК, торможения репарационной системы и т.д. В соответствии с характером изменения генетического аппарата различают мута­ции генные, хромосомные и геномные.

Генные, или точечные, мутации заключаются в изменении химической струк­туры генов. К ним относятся:

транзиция – обмен пуринового основания на пуриновое или пиримидинового на пиримидиновое.

трансверсия – обмен пуринового основания на пиримидиновое или наоборот;

инсерция – вставка одной или нескольких пар оснований;

делеция – выпадение одной или нескольких пар оснований.

Инсерцию и делецию называют также мутациями со сдвигом рамки.

Хромосомные мутации (в отличие от генных) отражаются на внешнем виде хромосом, наблюдаемом в световой микроскоп. Вещества, которые вызывают хро­мосомные мутации, называются мутагенами. Важнейшими типами хромосомных мутаций являются:

делеция – утрата части хромосомы;

дупликация – удвоение участка хромосомы;

инверсия – поворот фрагмента хромосомы;

транслокация – обмен участками хромосом.

Кольцевые хромосомы тоже подвержены мутациям.

Геномные мутации подразделяют на анеуплоидии и полиплоидии11. Анеуплоидией называют изменение количества отдельных хромосом – уменьшение (нулли- и моносомия) или увеличение (три-, тегра- и полисомия) их числа, т.е. несбалансированный хромосомный набор. Полиплоидия – это уве­личение числа хромосомных наборов соматических клеток по сравнению с обыч­ным диплоидным.

Для проверки на мутагенность используются как тесты in vitro – с микроор­ганизмами (бактериями, дрожжами, грибами и др.) и клеточными культурами (в том числе культурами лимфоцитов человека), так и тесты in vivo – с растениями, насекомыми (особенно вида Drosophila melanogaster), мелкими грызунами (осо­бенно мышами). Так как различные способы испытаний обнаруживают разные, уязвимые для тестируемых веществ места генетического субстрата, необходимо применять несколько методов проверки мутагенности (так называемая «тест-батарея»).

Условия проведения таких испытаний (мутационного теста по Эймсу, теста на трансформацию клетки, теста на хромосомные мутации, микроядерного теста и др.) опубликованы в официальных изданиях. Получаемые результаты требуют исключительно осторожной интерпретации, поскольку ошибки могут быть как в сторону завышения, так и в сторону занижения.

Самый известный, бесспорно, тест Эймса. Он основан на том, что опреде­лённые штаммы Salmonella typhimurium, которые вследствие мутации потеряли свою способность к синтезу гистидина, под влиянием мутагенов могут мутиро­вать в первоначальную форму (ревертанты) и вследствие этого расти на сво­бодных от гистидина питательных средах. Разные штаммы S. typhimurium (ТА 98, ТА 100, ТА 1535) имеют склонность к различным типам мутации, следователь­но, выбором штамма можно получить некоторое представление о типе возни­кающей мутации. При тестировании по Эймсу могут возникнуть трудности – иногда консерванты оказывают тормозящее действие на S. typhimurium.

Наряду со многими другими весьма популярен также микроядерный тест (см. общую литературу).

Испытания на мутагенность имеют особое значение для токсикологической оценки вспомогательных веществ и пищевых добавок, поскольку мутагенность и канцерогенность (по меньшей мере для генотоксичных веществ) почти всегда встречаются одновременно.

§5. Репродуктивная токсичность

Исследования по репродуктивной токсичности включают проверку влияний данного вещества на мужскую и женскую плодовитость и общую способность к продолжению рода, на внутри- и послеутробное развитие, а также выяснение наличия у него тератогенных свойств.

Под тератогенностью вещества понимают его способность вызывать появле­ние уродств у эмбрионов. Тератогены принципиально недопустимы в качестве вспомогательных веществ в пищевых технологиях и добавок в продуктах пита­ния. В то же время некоторые природные составляющие пищевых продуктов (на­пример, спирт) обладают значительной тератогенностью, а вызываемая спиртом алкогольэмбриопатия считается серьёзной токсикологической проблемой.

Для проверки на тератогенность беременным животным дают тестируемое вещество в критических фазах эмбрионального развития. Определяют, и частно­сти, число имплантаций эмбрионов, число их ранних и поздних рассасываний, число живых и мёртвых зародышей, положение и распределение зародышей в маточных трубах, массу приплода, уродства скелета и органов.

В процессе эмбрионального развития различные органы в разное время и в разной степени восприимчивы к тератогенным факторам. Поэтому при изуче­нии тератогенеза важную роль играет время экспозиции.

К настоящему времени очень хорошо описано тератогенное действие талидомида («контерган-катастрофа»12), спирта и диэтилстильбэстрола, который за­нимает особое место в трансплацентарном индуцировании опухолей. Имеются указания на тератогенность антагонистов фолиевой кислоты (аминоптерин) и синтетических прогестинов.

§6. Подострая токсичность¹³

Испытания на подострую токсичность имеют обычно продолжительность 28 дней и представляют собой промежуточное звено между исследованиями ост­рой (однократное введение вещества и наблюдение в течение 1-2 недель) и суб­хронической токсичности (ежедневное введение вещества в течение 90 дней и более, см. §7 гл.3). Путем многократного (обычно 3-кратного) введения вещест­ва за сравнительно короткое время в этих испытаниях пытаются обнаружить воз­можное кумулятивное токсическое действие тестируемого вещества или его ме­таболитов. В рамках этих же исследований выясняют, происходит ли адаптация организма к испытуемому веществу и не проявляют ли какие-либо конкретные органы особой чувствительности к нему. Это можно определить, например, из­мерением активности различных ферментов печени.

§7. Субхроническая токсичность

При исследовании субхронической токсичности испытуемое вещество скарм­ливают в течение 3-6 месяцев (т.е. в течение срока, составляющего приблизи­тельно 10% продолжительности жизни подопытных животных). Для опытов ис­пользуют обычно грызунов (крыс, мышей или хомяков) и другие виды животных (собак или свиней). Чтобы иметь возможность обнаружить различия действия в зависимости от пола, включают в опыт равное число мужских и женских особей. Необходимо использовать достаточно большое число животных, чтобы можно было сделать статистическую оценку. В опытах участвует и некоторое количест­во контрольных животных, которых содержат в тех же условиях, что и подопыт­ных, но им не скармливают исследуемое вещество. Проверяемое вещество при­меняют в нескольких дозах (не менее трёх). Наивысшая из них должна находить­ся в области, в которой несомненно можно ожидать токсического действия. Таким образом узнают, какие органы подвержены воздействию испытуемого веще­ства. В дальнейших опытах уделяют им особое внимание.

Опыты по субхронической токсичности включают исследования живых животных и их трупов (по окончании опыта).

У живых животных наблюдают и изучают внешние параметры, такие, как поведение, изменение массы тела, потребление пищи и воды. Проверяют внеш­ний вид и состав мочи и фекалий, наличие в них нефизиологических веществ и других отклонений от нормы. Проводят клинико-биохимические исследования крови и её сыворотки, которые дают информацию о выполнении органами важ­нейших функций. По окончании опыта животных забивают. Определяют массу главных внутренних органов и затем подвергают их макроскопическому и гисто­логическому исследованию. Особое внимание обращают на печень и почки, по­скольку именно их функции связаны в первую очередь с обменом веществ и сек­рецией. Часто они реагируют на скармливание повышенных доз определённых веществ небольшим и обратимым увеличением, не сопровождающимся гистоло­гическими изменениями. Это увеличение может быть объяснено биологической реакцией на стрессовую ситуацию.

Для исследования субхронической токсичности доза тестируемого вещества должна быть выбрана так, чтобы, с одной стороны, токсическое действие было явно заметно, с другой – подопытные животные остались живы. Испытания на субхроническую токсичность, наряду с уже упомянутыми целями (выяснение воз­можности адаптации к исследуемому веществу, накопления его в организме жи­вотного, «обратимости» причиняемого им вреда; определение «целевых органов»), служат и для оценки диапазона доз и способа введения вещества в организм при изучении хронической токсичности (см. §8 гл 3).

§8. Хроническая токсичность

Под хронической токсичностью понимают итоговое действие, которое может быть обнаружено после скармливания вещества в течение 2 лет и более. Скарм­ливание вещества в течение длительного времени позволяет обнаружить такие явления, как канцерогенез или возрастная зависимость восприимчивости опреде­лённой ткани. Поэтому опыты по определению хронической токсичности рассмат­риваются как важный элемент оценки потенциального риска пищевой добавки.

В опытах по хронической токсичности особенно важно использовать доста­точно большое количество животных. Это позволяет дать статистическую оцен­ку результатам наблюдений, сокращая доверительный интервал вероятности биологического события, и обнаружить редко встречающиеся явления. В осталь­ном используют тс же принципы, что и в опытах по субхронической токсичности (см. §7 гл. 3).

Проверяемое вещество даётся животным в более высоких дозах. При выбо­ре доз опираются на результаты предшествующих опытов по субхронической ток­сичности. Следует учитывать, что определённое количество испытуемого веще­ства может находиться в пище естественным образом.

В испытаниях на хроническую токсичность следует соблюдать следующие правила:

-    в качестве наибольшей использовать такую дозу, которая в опытах по суб­хронической токсичности еще не оказывала никакого действия;

-    не применять корм с содержанием испытуемого вещества выше 5%;

-    иметь в виду, что результаты, полученные в условиях стресса или в других специфических условиях, могут быть не связаны с исследуемым веществом;

-    использовать диету, сбалансированную по калорийности (при этом сле­дует учитывать, что некоторые вещества в высоких дозах влияют на усвоение пищи);

-    учитывать, что исследуемое вещество в повышенных концентрациях мо­жет изменять органолептические свойства корма; иногда это становится причи­ной частичного отказа подопытных животных от приема корма и, как следствие, может отрицательно сказаться на их развитии.

В исследованиях по хронической токсичности наблюдают прежде всего раз­витие животных, их поведение, функции отдельных органов (имеющие внешние проявления) и ферментативные реакции. Подопытных животных или забивают по окончании опыта, или содержат до наступления естественной смерти. Все жи­вотные подвергаются вскрытию. Гистологические исследования в первую оче­редь проводятся на животных, принимавших высокие дозы испытываемого ве­щества и имеющих макроскопические поражения, опухоли. Изучаются следую­щие органы и ткани: лимфатические узлы, молочные и слюнные железы, бед­ренные кости или позвонки (включая костный мозг), гипофиз, трахеи, лёгкие, сердце, щитовидная железа, пищевод, желудок, тонкий кишечник, ободочная кишка, печень, желчный пузырь, поджелудочная железа, селезёнка, почки, над­почечники, мочевой пузырь, простата, яички, яичники, матка, головной мозг, глаза, спинной мозг. Особенности распределения испытываемого вещества в ор­ганизме могут потребовать исследований и других органов и тканей.

Результаты исследования должны быть правильно интерпретированы. Крайне важно оценить возможность их переноса на человека и предполагаемый риск. К пищевым добавкам сегодня предъявляют требования по безопасности более высокие, чем к лекарствам. Побочное действие лекарства обычно несоизмеримо меньше той опасности для здоровья, которую оно предотвращает. Поэтому с ним смириться легче, чем с побочным действием пищевой добавки.

Перечисленные оценки позволяют определить уровень (дозу) потребления добавки, при котором не обнаруживается никакого отрицательного действия. Он называется «уровень, не вызывающий наблюдаемого действия» (no-observed-effect-level – NOEL), представляет собой наивысшую дозу, не оказывающую ток­сического действия, и служит основой для установления «допустимого суточно­го поступления» – ДСП (см. §11 гл.3). Отношение дозы, безопасной в долго­срочных токсикологических опытах, к концентрации в продукте питания назы­вается степенью реальной безопасности.

В табл. 3 приведены значения степени реальной безопасности некоторых ве­ществ, проявляющих консервирующее действие (чем выше значение степени ре­альной безопасности, тем менее рискованно применение данного вещества).

Таблица 3. Степени реальной безопасности некоторых веществ

Обратим внимание на то, что давно известные вещества, которые много­кратно рекомендовались международными организациями в качестве консерван­тов, имеют наименьшие степени реальной безопасности. Уточним, что добавки, разрешённые в качестве консервантов, могут применяться только в довольно ма­лом числе продуктов питании и в определённых законом количествах. В то же время поваренная соль и сахар содержатся во многих продуктах питания не как консерванты, к тому же в концентрациях гораздо больших, чем специализиро­ванные консервирующие добавки.

§9. Канцерогенность

Вспомогательные вещества и пищевые добавки могут приниматься вместе с пищей длительное время, в том числе детьми и подростками, поэтому возмож­ность их участия на различных стадиях канцерогенеза должна быть исследована в высшей степени детально. Как известно, развитие опухолей – процесс дли­тельный и поэтапный. В соответствии с концепцией многоступенчатости он мо­жет быть подразделён на следующие фазы; экспозиция, инициация, промотирование, конверсия и прогрессирование.

Согласно этой концепции вещества, с одной стороны, могут действовать как инициаторы рака (например, гепотоксичные агенты), а с другой стороны, в ка­честве промоторов могут способствовать образованию опухолей (например, форболовый эфир или этанол). Только совместное действие инициаторов и промо­торов ведёт последовательно через конверсию (превращение предканцерогенных поражений в злокачественную опухоль) и прогрессирование (развитие и рас­пространение метастазов) к формированию общей картины ракового заболевании.

Инициаторами возникновения рака в большинстве случаев являются гепо­токсичные вещества, т.е. вещества, способные ковалентно модифицировать ДНК. Наряду с генотоксичными канцерогенами существуют негенотоксичные (эпиге­нетические) канцерогены, например сахарин, лимонен или бутилоксианизол, чьё действие обнаружено до сих пор только для некоторых видов живот­ных. В случае генотоксичных агентов важно, является зависимость доза–дейст­вие линейной или нет. Например, для формальдегида эта зависимость нелинейна, так что может быть сомнительным наличие порогового значения индуцирован­ного формальдегидом канцерогенеза. Поскольку наибольшее значение для об­разовании опухолей имеют генотоксичные агенты, обнаружение ковалентного связывания испытуемого вещества (или его метаболитов) с ДНК (ДНК-аддукта) играет особую роль в выявлении его канцерогенного действии. У человека обра­зование аддуктов ДНК с афлатоксином В1, может быть обнаружено иммунологически или с помощью ВЭЖХ. Такие способы оценки риска получили название «молекулярная дозиметрия».

Так как появлению опухоли может предшествовать значительный инкуба­ционный период, канцерогенное действие вещества проверяют методом корм­ления животного в течение всей жизни, начиная с возможно более раннего воз­раста. Наиболее подходящие подопытные животные – мыши и крысы, посколь­ку у них невелика продолжительность жизни. Как подопытная, так и контроль­ная группы животных должны быть достаточно велики. Обычно канцерогенность исследуют на двух видах животных.

Исследования по канцерогенности продолжительны и дороги; поэтому, а так­же из соображений защиты животных (не в последнюю очередь) ведутся интен­сивные поиски более быстрых методов испытаний. К сожалению, разработан­ные до сих пор способы недостаточно надёжны и не могут полностью заменить опыты на животных. Такого рода методом может служить тест на мутагенность (см. §4 гл. 3). Однако отсутствие мутагенности не гарантирует отсутствия канце­рогеннонности. Некоторые вещества (преканцерогены), будучи сами по себе в этом отношении безопасными, в организме превращаются в канцерогенные метаболиты (вторичные канцерогены), которые, например, соединяются с ДНК. В ре­зультате они действуют как инициаторы канцерогенеза. Для проверки возмож­ности такого взаимодействия тестируемое вещество, меченное радиоактивным изотопом, вводится крысам; через несколько часов или дней из органов под­опытных животных (предпочтительно печени) выделяют ДНК и определяют её радиоактивность. Последняя служит мерой количества связанного исследуемого вещества (индекс ковалентного связывания). Канцерогены и неканцерогенные вещества отличаются по величине этого индекса в 1-100 тысяч раз. Сущест­вуют и другие способы определения наличия ковалентной модификации ДНК.

При проверке консервантов на канцерогенность их вводят перорально (скармливают). При парентеральном введении появление опухоли в месте инъ­екции не рассматривается как доказательство канцерогенности, если она остаёт­ся локализованной в месте ввода и если нет иных доказательств канцерогенного действия. Это связано с тем, что при инъекции (особенно многократной) пора­жения тканей могут появляться из-за хронического раздражения и воспаления; Такой процесс может не иметь ничего общего с действием исследуемого вещества.

Некоторый интерес представляют эпидемиологические исследования канцерогенности веществ, известных и уже длительное время применяемых в пище­вой химии. Однако выводы таких исследований спорны из-за трудностей интер­претации результатов. Для разрешенных к применению веществ эпидемиологи­ческое изучение невозможно в любом случае.

Важной проблемой при исследовании канцерогенного действия пищевых до­бавок является оценка порогового значения, т.е. дозы, которая еще не вызывает нежелательного действия. Аргументы в пользу постулируемой некоторыми авто­рами необратимости канцерогенных явлений базируются на исследованиях доза-действие, на экспериментах, которые охватывали несколько поколений подо­пытных животных, а также на концепции мутаций соматических клеток, как пер­вом шаге канцерогенеза, и переноса возникших дефектов при делении клеток. Проблема экстраполяции результатов опытов с высокими дозами с животных на человека решена ещё не полностью.

Из опытов на животных известно, что многие вещества, которые в высоких дозах проявляют канцерогенное действие, в малых дозах опухолей не дают (на­пример, формальдегид).

Кроме того, известно множество веществ, которые в высоких концентраци­ях проявляют канцерогенное действие и в то же время содержатся естественным образом в продуктах питания (в малых количествах). Некоторые вещества, по­требляемые в больших количествах с пищей и напитками (например, спирт), на основании опытов с животными находятся под подозрением, как инициаторы или, в меньшей мере, промоторы опухолей (пищевода, прямой кишки, молоч­ной железы). Особенно острая ситуация с проблемой канцерогенности добавок существует в США. Там имеет силу закона так называемая поправка Делани («Delaney anticancer clause»). Она гласит, что вещество не может быть разре­шено к применению в продуктах питания, даже в ограниченном количестве, ес­ли оно проявляет канцерогенное действие у человека или животного в любой, даже самой высокой концентрации. Правда, поправка Делани имеет силу только для добавок, но не для самих пищевых продуктов.

§10. Аллергенное действие

Симптоматика, обозначаемая в обычном словоупотреблении как «пищевая аллергия», в научном смысле делится па истинную пищевую аллергию (как им­мунная реакция выработки комплексов антиген-антитело) и реакции неперено­симости пищи (не связанные с иммунной системой).

Вопреки широко распространённому мнению, ответственными за такою рода реакции чаще всего являются не консерванты и вообще не добавки, а естествен­ные составляющие продуктов питания (белки орехов, коровьего молока, хлеб­ных злаков).

Истинные пищевые аллергии (ИПА) – это так называемые аллергии немед­ленного типа (реакция типа 1), например сенной насморк. Они обусловлены уско­ренным образованием специфических антител (иммуноглобулин Е) против аллер­гена и сопровождаются выделением медиаторов, таких, как гистамин или брадикинин. Эти медиаторы, в конечном счёте, ответственны за симптомы ИПА. Наследственная предрасположенность к такого вида реакциям называется атопией. От ИПА следует отличать так называемую реакцию позднего типа (реакция ти­па IV), которая протекает с участием не только антител, но и Т-лимфоцитов, мак­рофагов и т.д. Пример такого рода реакции – аллергия на никелевые украшения.

От истинных аллергических явлений следует отличать непереносимость про­дуктов питания (НПП), а также псевдоаллергические реакции (ПАР). НПП мо­жет быть вызвана как врождёнными, гак и приобретенными ферментными де­фектами (примеры: непереносимость лактозы, непереносимость алкоголя мно­гими жителями Азии) и по своим симптомам (как и ПАР) трудноотличима от истинной аллергии.

Известно, что некоторые красители, антиоксиданты, ферментные препара­ты и консерванты вызывают аллергию и реакции непереносимости. Для людей, чувствительных к веществам такого рода, на потребительской упаковке продук­товых товаров указываются содержащиеся в них добавки, чтобы эти люди могли воздержаться от их употребления. Что касается консервантов, то здесь положе­ние осложняется тем, что некоторые из них могут оказаться в составе пищи не только искусственным, но и естественным путём, так как встречаются в нату­ральных продуктах. Например, салициловая кислота уже давно не применяется в качестве добавки, но люди, чувствительные к ней, могут страдать от аллергии, так как это вещество встречается в природном продовольственном сырье. Бен­зойная кислота, а также n-оксибензойная кислота и её эфиры и встречаются в природе, и применяются в качестве искусственных добавок. Следовательно, оба источника этих веществ могут быть причиной соответствующих реакций.

Из применяемых сегодня консервантов аллергенами считаются прежде все­го сульфиты (особенно для астматиков), бензойная кислота и парабены. Пропионовая и сорбиновая кислоты аллергенами не являются.

§11. Допустимое суточное поступление

Самым надежным способом проверки опасности консерванта были бы не­посредственные испытания па человеке. Но по известным соображениям они возможны только в конце успешного исследования и только в ограниченном объ­ёме. Поэтому заключения о влиянии на человека приходится делать по результа­там опытов на животных

Объединённый комитет экспертов ФАО/ВОЗ19 (JECFA) и Научная комис­сия по пищевым добавкам Европейского Сообщества (SCF) устанавливают на основе результатов токсикологических исследований величину допустимого су­точного поступления – ДСП (acceptable daily intake – ADI). ДСП определяет количество вспомогательного вещества или пищевой добавки (в миллиграммах на 1 кг массы тела в день), которое может потребляться человеком в течение всей жизни. ДСП указывает границу, незначительные нарушения которой допустимы.

ДСП равно дозе вспомогательного вещества или пищевой добавки, которая ещё не оказывает токсического действия в опытах по хронической токсичности (NOEL, см. §8 гл. 3), делённой на коэффициент безопасности. Этот коэффици­ент обычно принимается равным 100. Он может быть больше, если для этого есть особые причины, либо меньше, если речь идёт о веществе, которое является обыч­ной составляющей пищи человека, или если путь распада данного вещества по­добен пути распада обычных компонентов пищи.

Коэффициент безопасности учитывает следующие обстоятельства:

-    токсикологические исследования пищевых добавок проводят в основном на животных; перенесение на человека результатов опытов с животными сопря­жено с некоторым, пусть даже небольшим, риском;

-    многие животные в расчёте на 1 кг массы тела потребляют пищи больше, чем человек (крыса, например, в 7-8 раз);

-    часто в пище содержится несколько добавок одновременно; хотя синер­гизм в токсикологии редок, его возможность тоже должна быть учтена;

-    продукты, содержащие пищевые добавки, потребляются в числе прочих и людьми, имеющими особенности метаболизма.

-    детьми, больными, пожилы­ми людьми, беременными и кормящими грудью; это вносит дополнительный фак­тор риска, который учитывается при установлении ДСП;

-    значение ДСП устанавливается в расчёте на потребление продукта с пи­щевой добавкой в течение всей жизни, а также учитывает вариации индивиду­ального потребления.

В тех случаях, когда JECFA считает, что токсикологическая безопасность вещества выяснена ещё недостаточно, устанавливается временное ДСП. Суще­ственные составляющие продуктов питания, нормальные продукты обмена ве­ществ человеческого организма или вещества очень малотоксичные имеют не­ограниченное ДСП.

Если в токсикологической безопасности уже разрешённого вещества появ­ляются сомнения, то статус его ДСП «понижается» с постоянного до временного и предлагается провести дополнительные исследования. Так, SCF в феврале 1994 года перевела значения ДСП для бензойной кислоты и парабенов (соответственно 0-5 и 0-10 мг на 1 кг массы тела) из постоянных во временные и пред­полагала по окончании дополнительных исследований в 1996 году заново их об­судить. JECFA пока не присоединились к этому решению, т.е. эти две организа­ции предлагают одинаковые по значению, но разные по статусу величины ДСП. В значениях ДСП, установленных JECFA и SCF, могут существовать и количе­ственные различия. В настоящее время дня консервантов действуют значения ДСП, приведённые в табл. 4.

Доза исследуемого вещества, лежащая в основе ДСП (т.е. не оказывающая токсического действия, NOEL), указывается на 1 кг массы тела. В то же время, если в опытах на животных исследуемое вещество добавляется в корм, то и при­водят его содержание в корме. Для пересчёта доз из одной системы в другую достаточно знать массу животного и количество потребляемого им корма. При­меры приведены в табл. 5.

Непосредственный переход от ДСП к концентрациям, разрешённым в про­дуктах питания, затруднителен. Тем не менее установленное значение ДСП необходимо для законодателя, как опорная точка при разрешении добавки и ус­тановлении максимальных её концентраций в пищевом продукте. Можно отме­тить (принимая во внимание коэффициент безопасности), что кратковременные превышения ДСП не несут никакого риска.

Фактическое потребление пищевых добавок обычно значительно ниже ДСП. Расчёты показывают, что потребление консервантов в Германии составляет 1-10% от ДСП; однако есть и исключения, например диоксид серы.

Таблица 4. Допустимое суточное поступление некоторых консервантов (по JECFA)

* Групповое ДСП (в пересчете на кислоту).

** Кроме продуктов для детского питания, в которые добавление нитратов запрещено. 

Таблица 5. Взаимный пересчет токсикологических данных

От ДСП следует отличать «допустимый уровень» (permissible level – PL), «терпимый ежедневный прием» (duldbare tägliche Aufnahme – DTA) и «условно переносимое недельное поступление» (provisional tolerable weekly intake – PTWI). Допустимый уровень выражается в миллиграммах на 1 кг пищевого продукта и представляет собой произведение ДСП и массы тела, деленное па долю данного пищевого продукта в усреднённом рационе. Этот уровень указывает предельную концентрацию добавки. В продукте питания, при которой его среднестатистиче­ское потребление не приводит к превышению ДСП добавки. Для пестицидов ввиду отсутствия для них значений ДСП, Федеральным управлением здравоохра­нения Германии устанавливается терпимый ежедневный приём. Значе­ния условно переносимого недельного поступления устанавливаются ФАО/ВОЗ для тяжёлых металлов и остатков фармакологических препаратов.

§12. Смеси консервантов

На практике часто используют смеси различных консервантов. Не исключе­но, что смеси могут иметь иные токсикологические свойства, чем отдельные веще­ства. Оказалось, что это не относится к LD50, а также к субхронической токсич­ности при скармливании 2-20% от LD50 в течение 6 месяцев. Исследования про­водили с дегидрацетовой, сорбиновой, бензойной, салициловой, пропионовой кислотами, этиловым, пропиловым и бутиловым эфирами n-оксибензойной ки­слоты (частично в виде натриевых солей) и фурилфурамидом. Обнаружено, что только сочетание бензойной кислоты и сульфита ведёт себя в опыте по хрониче­ской токсичности несколько хуже, чем каждое из этих веществ в отдельности [33].

Смеси нитритов и сорбиновой кислоты в повышенных дозах проявляют ток­сическое действие не сильнее, чем соответствующие количества нитрита сами по себе. Скармливание смеси из 13 пищевых добавок, чаще всего используемых в Японии, в течение 12 месяцев показало, что при 10-кратном превышении по от­ношению к ежедневно потребляемому количеству наблюдается лишь небольшое токсическое действие; это действие было существенным только при 100-кратной передозировке. Среди этих добавок были следующие консерванты: бензоат на­трия, сорбат калия, пропионат натрия, бутиловый эфир п-оксибензойной ки­слоты, дифенил и натриевая соль дегидрацетовой кислоты.