В результате действия ряда ферментов (как нативных, так и микробного происхождения) на компоненты молока образуются не свойственные свежему молоку различные химические соединения, которые при определенных концентрациях ухудшают его органолептические показатели, влияют на технологические свойства, снижают стойкость молока в хранении и в конечном итоге влияют на качество вырабатываемой из него молочной продукции. Вот почему определение активности ряда ферментов позволяет оценить качество сырого молока прежде, чем его используют для производства того или иного молочного продукта.

Активность редуктаз. Величину окислительно-восстановительного потенциала (Еh) свежевыдоенного нормального молока обусловливает содержащиеся в нем окислительно-восстановительные системы. При хранении молока вследствие обмена веществ микроорганизмов происходит изменение его Еh. Это обусловлено потреблением клетками микроорганизмов кислорода и образованием внеклеточных редуктаз, которые оказывают восстановительное действие. Потенциалоснижающее действие различных видов микроорганизмов разнообразно.

Повышенное содержание кислотообразователей в неохлажденном молоке – лактококков и молочнокислых палочек – приводит к быстрому падению Еh. В охлажденном молоке рост этих микроорганизмов замедлен, содержание продуктов обмена веществ, в том числе и ферментов, оказывающих восстановительное действие, незначительно, и резкого падения Еh не отмечается. Поэтому измерение Еh молока с применением окислительно-восстановительных индикаторов в виде пробы на восстановление (редуктазная проба) используется в качестве косвенного метода определения общей бактериальной обсемененности молока. Суммарная (нативная и микробная) редуктазная активность сырого молока является тестом прогнозирования его стойкости при хранении.

В качестве окислительно-восстановительных индикаторов используют метиленовый голубой, резазурин и 2,3,5-трифенилтетразолия хлорид. Эти индикаторы изменяют окраску при различной величине Еh: +0,011 В, +0,151 В и при –0,200 В соответственно. Поэтому цвет индикатора в молоке изменяется тем раньше, чем меньше разность Еh молока (для нормального молока Еh составляет +0,2...+0,3 В) и индикатора. Вот почему при применении резазурина требуется меньше времени на реакцию, чем при использовании двух других указанных индикаторов.

В табл. 46 показаны различия в способности редуктаз некоторых бактерий восстанавливать метиленовый голубой и резазурин (Загаевский И. Р., Крамаренко В. В., 1980). Для этого сырое молоко, полученное в асептических условиях, обсеменяли наиболее часто обнаруживаемыми в нем микроорганизмами в количестве 0,5...0,7 и 4...6 млн КОЕ/мл и затем определяли класс молока по редуктазной пробе с использованием метиленового голубого и резазурина.

Таблица 46

Используемые в опыте микроорганизмы, за исключением лактококков и бактерий группы кишечной палочки, не восстанавливали или медленно восстанавливали метиленовый голубой и обладали большей способностью восстанавливать резазурин. Поэтому молоко, содержащее большое количество психрофильной и термостойкой микрофлоры, может быть оценено посредством редуктазной пробы с резазурином лучше, чем молоко, содержащее меньшее количество этой микрофлоры. Сравнительная оценка 3700 проб сборного сырого молока показала, что резазурин, по сравнению с другими индикаторами, имеет преимущества не только в значительном сокращении продолжительности анализа, но и в том, что изменение цвета индикатора не является обратимым процессом, выявляются редуктазы большего числа микроорганизмов, обнаруживается молоко коров, больных маститом различной этиологии. Установлена обратная зависимость между продолжительностью обесцвечивания индикаторов и количеством бактерий или их редуктазной активностью. Исследования на более чем 1000 образцов сырого молока, показали, что между результатами, полученными с помощью редуктазной пробы с использованием резазурина, и определением общего количества бактерий чашечным методом может быть получен довольно высокий коэффициент корреляции – 0,8. Предварительная выдержка около двухсот проб сырого охлажденного молока перед анализом в течение 16 ч при 15°С несколько повышало степень корреляции в случае использования резазурина и снижала – в случае метиленового голубого. Результат редуктазных проб зависит от вида, фазы развития и количества микроорганизмов, времени года, продолжительности и температуры хранения молока до анализа, концентрации индикаторов, наличия ингибирующих веществ, примеси анормального молока и др. Эти факторы могут влиять на объективность результатов, получаемых при проведении редуктазной пробы (Королева Н. С., Семенихина В. Д., 1980; Lück Н., 1991). Редуктазная проба с использованием резазурина включена в оценку качества сырого молока при его оплате в большинстве стран с молочным животноводством.

Для определения нитратредуктазной активности микрофлоры молока используют тест на восстановление добавленного к молоку нитрата, который более пригоден для охлажденного и хранившегося при достаточно низких температурах сырого молока, в котором преобладают психрофильные микроорганизмы и колиформы в случае более 200 тыс. КОЕ/мл. Анализ около 300 проб хранившегося молока (без предварительной выдержки) показал, что коэффициент корреляции между общим бактериальным обсеменением молока по чашечному методу и нитратным тестом составил ≈ –0,6. Этот тест практически не пригоден в случае ≤ 50 тыс. КОЕ/мл молока. Предварительная выдержка молока перед анализом в течение 16 ч при 15°С рекомендуется в случае продолжительности восстановления добавленного нитрата более, чем 5 ч при 30°С. Так, если 63...75% образцов молока, содержащих менее 200 тыс. КОЕ/мл, показали 5-ти час. нитратный тест, то после вышеуказанной выдержки уже 89...93% образцов молока показали 3-х час. нитратный тест (Lück Н., 1991).

При развитии в молоке микроорганизмов основным промежуточным продуктом ферментативных реакций расщепления углеводов, а также жира и белка является пировиноградная кислота. В образовании пировиноградной кислоты принимают участие, например, лактатдегидрогеназа, малатдегидрогеназа, аланинаминотрансфераза, триптофаназа, пируватдекарбоксилаза и другие ферменты. Поскольку лактатдегидрогеназа обратимо восстанавливает пировиноградную кислоту в молочную, поэтому по содержанию в молоке пирувата и лактата косвенно определяют общую бактериальную обсемененность молока (табл. 36, с. 156). В свежем молоке содержание пирувата не превышает 0,15 мг%. На его содержание в молоке влияют температура и продолжительность хранения молока до анализа, видовой и количественный состав микрофлоры (грамотрицательные бактерии образуют больше пировиноградной кислоты), содержание соматических клеток и другие факторы (Suhren Е., Heeschen W., 1985, 1991).

Из табл. 47 видно, что между содержанием пирувата и общей бактериальной обсемененностью молока имеется тесная связь, но в случае общей бактериальной обсемененности менее 100 тыс. КОЕ/мл отмечается невысокая корреляция между этими показателями. При менее 100 тыс. КОЕ/мл имеет значение физиологический фон пирувата, определяемый здоровьем молочной железы, кормлением, различием в метаболизме лактации, особенно высокоудойных коров (Cousins С. М., 1981).

Таблица 47

Установлена логарифмическая зависимость между содержанием пирувата и бактериальной обсемененностью сырого молока (анализ 825 проб сырого молока). Коэффициент корреляции между этими показателями составил 0,57 в пределах содержания пирувата 0,05...0,3 мг% и 5 · 10⁴...1 · 10⁶ КОЕ/мл (Suhren Е., Heeschen W., 1991).

Таким образом, по концентрации пирувата можно осуществлять прогнозирование стойкости сырого молока в хранении только при уровне общей бактериальной обсемененности более 100 тыс. КОЕ/мл и учитывать этот показатель при оплате молока-сырья.

Данные, приведенные в табл. 48 показывают заметные изменения содержания пирувата при хранении сырого молока, а также интенсивность накопления пирувата штаммами L. lactis, Е. coli, Ps. fluorescens, в качестве превалирующей микрофлоры сырого молока (более активным был штамм Ps. Fluorescens).

Таблица 48

Показано, что коэффициент корреляции между содержанием пирувата и общей бактериальной обсемененностью в случае неохлажденного сырого молока с преобладанием молочнокислых над психрофильными бактериями значительно ниже – 0,4 по сравнению с охлажденным молоком, где преобладают психрофильные бактерии – 0,7, что объясняется обратной пропорциональностью между содержанием пировиноградной и молочной кислот (Kisza J., Sajko W., 1981).

Преимуществом использования концентрации пирувата в качестве косвенного показателя бактериальной обсемененности молока является то, что его можно определять в консервированных пробах, и то, что при пастеризации и УВТ-обработке молока эта концентрация практически не изменяется. Поэтому этот показатель можно с успехом использовать для контроля качества питьевого молока по исходному сырому молоку (Leali L. et аl., 1985).

В ряде стран величина содержания в молоке пирувата включена в оценку его качества при оплате. Например, в Германии для молока 1-го класса была установлена величина концентрации пирувата менее 0,16, 2-го класса – 0,17...0,24, 3-го класса – 0,25...0,28 и 4-го класса – более 0,28 мг%, а в Польше – 1 класс – до 0,15, 2 класс – 0,15...0,3 и 3 класс – более 0,3 мг%.

Отмечают определенную положительную связь между содержанием пирувата в молоке и содержанием в нем соматических клеток. Так, в молоке, полученном практически в асептических условиях, содержание пирувата находилось в пределах 0,05...0,15 мг% при 90...480 тыс/мл и 0,07...0,41 мг% при 520...4740 тыс/мл соматических клеток (Славчев Г., 1981).

Активность лактатдегидрогеназы по образованию лактата используют для оценки качества неохлажденного сырого молока, где доминирующей является мезофильная микрофлора – лакто- и микрококки. Результаты исследований показали, что коэффициент корреляции логарифмической зависимости между этими показателями (анализ 825 проб сырого молока) составляет 0,63 в пределах содержания лактата 0,5...5 мг% и 5 · 10⁴...1 · 10⁶ КОЕ/мл (Suhren Е., Heeschen W., 1991).

Активность оксидаз. Одной из важных функций почти всех из обнаруженных в молоке оксидаз (как и пероксид-дисмутазы) является образование перекиси водорода – компонента лактопероксидазо-антибактериальной системы молока. Вместе с тем, продукты реакций, катализируемых оксидазами, могут быть причиной окисленного или других пороков вкуса молока. Поэтому определение активности этих ферментов может служить тестом прогнозирования стойкости сырого молока при хранении.

В качестве критерия для оценки гигиенического состояния сырого охлажденного молока служит цитохромоксидазная активность (или сокращенно – оксидазная активность). Считают, что если оксидазоположительные психрофильные бактерии составляют более 16% общего количества микроорганизмов, то такое молоко является уже сомнительным по гигиеническому состоянию, и возникает необходимость проверки санитарных условий получения молока на ферме. Считают, что оксидазная проба неприменима для молока с большим количеством бактерий (молоко по редуктазной пробе 3-го класса), которые создают в молоке восстановительные условия. Установлено, что если продолжительность восстановления 1%-ного раствора N, N, N', N'-тетраметил-n-фенилендиамина дигидрохлорида цитохром с-оксидазами в сыром молоке при 30 °С составляет до 15 мин (лучше до 10 мин), то это молоко свежее, а от 15 до 30 мин – свидетельствует о значительной обсемененности молока оксидазоположительными микроорганизмами (Vandersant К., Nikelson R., Dill К., Hankin L., et al.; Kroll R. G., 1989; Шидловская В. П., 1982).

Высокая концентрация ксантиноксидазы в коровьем молоке служит основой теста дифференциации женского молока, в котором она отсутствует, овечьего и козьего молока, в которых этого фермента значительно меньше. Разработан специальный микротест для выявления сырого коровьего молока, добавленного к козьему, позволяющий обнаружить 1...2 % примеси коровьего молока в козьем (Monget D., Gelin М., Laviolett R, 1979). Как было отмечено выше, перемешивание молока вызывает частичную агломерацию шариков жира, а следовательно, и потерю их оболочечного материала. Поскольку ксантиноксидаза в основном связана с ОШЖ, перемешивание способствует повышению активности этого фермента в обезжиренной фазе молока, что может явиться тестом для контроля степени механического воздействия на жировую фазу молока (Stannard D. J.).

Заслуживают внимания изучение условий проявления нитрат- и нитритвосстанавливающей активностей ксантиноксидазы и использование ее для снижения содержания в молоке нитратов и высокотоксичных нитритов (Ананиади Л. И. и др., 1983; Шидловская В. П., Ананиади Л. И., Львов Н. П., 1990; Шидловская В. П., Князева Е. В., 1995; Шидловская В. П., Смотракова Н. И., 1996).

Активность пероксидаз. Величина активности каталазы используется для определения качества сырого молока. Так, каталазную активность молока применяют в качестве индекса числа и типа микроорганизмов молока. Установлена высокая корреляционная зависимость между каталазной активностью сырого молока и содержанием в нем общего количества микроорганизмов и в том числе психрофильных бактерий. Однако такая зависимость наблюдается только в молоке с содержанием общего количества бактерий менее 0,5 · 10⁵ КОЕ/мл (Шидловская В. П., 1982; Lück Н., 1991). Активность каталазы в молоке менее 25 % О₂ является низкой, 26...50 % О₂ – средней и более 50 % О₂ – величиной, свидетельствующей о достаточно высокой бактериальной обсемененности молока.

В целом, определение активности каталазы в сыром молоке в качестве объективного индекса его бактериальной обсемененности не рекомендовано по следующим причинам: наличие нативной каталазы; каталазной активности лейкоцитов; определяются только каталазоположительные микроорганизмы; частичная инактивация каталазы перекисью водорода; зависимость от температуры анализа; активность каталазы не всегда пропорциональна ее концентрации, а концентрация – количеству микроорганизмов в молоке (Lück H., 1991).

Как было рассмотрено выше («Хранение и транспортирование молока»), для проявления достаточной активности лактопероксизадо-антибактериальной системы молока, содержание лактопероксидазы в молоке должно быть 1...2 мкг/мл. В то же время, обычное содержание лактопероксидазы в молоке составляет 10...60 мкг/мл, что значительно больше. Поэтому контроль сырого молока на содержание и активность в нем лактопероксидазы в целях характеристики его потенциальной антибактериальной активности не представляется целесообразным. Вместе с тем, лактопероксидаза катализирует окисление перекисью водорода многих органических соединений, что вызывает изменение вкуса и запаха молока. В связи с этим, контроль ее активности в сыром молоке необходим для оценки и прогнозирования стойкости молока при хранении. Величину активности лактопероксидазы можно использовать как индикатор при обнаружении перекиси водорода, добавленной к молоку в качестве консерванта.

Величина активности пероксид-дисмутазы может служить тестом контроля развития окислительных процессов, в том числе процесса окисления липидов молока.

Активность липаз. Как было отмечено, содержание и активность липолитических ферментов в сыром молоке, а также состояние их субстрата – молочного жира – в значительной степени зависят от зоотехнических факторов, условий получения и первичной обработки, хранения и транспортирования молока.

Содержание в молоке липолитических ферментов, как нативных, так и микробного происхождения, не всегда еще является решающим фактором, определяющим склонность молока к липолизу. Дело в том, что ОШЖ защищает молочный жир от возможного действия липаз. Кроме того, следует учитывать, что нативная липаза в молоке в основном связана с казеином. Таким образом, обособленность липаз и их субстрата в молоке в той или иной степени препятствует развитию в молоке чрезмерного липолиза. Вместе с тем, необходимость определения липолитической активности молока важна в связи с изменением состояния шариков жира при первичной обработке молока и с высокой липолитической активностью психрофильной микрофлоры, активное развитие которой наблюдается при хранении молока при достаточно низких температурах (5...7°С). Изменение молочного жира, вызываемое микробными липолитическими ферментами, приводит к появлению значительных пороков вкуса и запаха молока. Поэтому липолитическая активность молока – важный критерий оценки его бактериальной обсемененности (особенно психрофильными микроорганизмами), а также прогнозирования изменения вкусовых показателей молока и молочных продуктов, производимых из него. Установлена (табл. 49) довольно высокая корреляция между липолитической активностью молока, степенью его бактериальной обсемененности – по редуктазной пробе и степенью липолизированности (Пояркова Г. С., Уманский М. С., Макарьина Н. В., Шолохова В. В.; Шидловская В. П., Аристова В. П., 1981; Шидловская В. П., 2004).

Таблица 49

В. Г. Артаментовой выявлена отчетливая взаимосвязь между запахом молока и содержанием в нем СЖК. Так, при содержании СЖК от 0 до 5 мг% молоко имело в 90 % случаев (из 68 образцов) чистый запах, с увеличением количества СЖК в молоке ощущался кормовой и мыльный запахи, при 20...30 мг% СЖК в молоке преобладал мыльный запах, а все образцы, содержащие более 35 мг% СЖК, имели рыбный запах. Молоко, содержащее более 20 мг% СЖК и имеющее рыбный запах, нельзя перерабатывать в продукты, которые такой порок обесценивает.

Степень липолиза молока обычно выражают в числах ADV (количество миллилитров 1 н. спиртового раствора КОН, пошедшее на титрование 100 г молочного жира или СЖК мэкв./100 г жира). По этому показателю предложена следующая оценка качества сырого молока: нормальное молоко – 0,4; «пограничное» – 0,7...1,1; молоко, по степени липолиза непригодное для переработки в молочные продукты – 1,5 и более.

В Нидерландах и во Франции в схему оплаты сырого молока включено содержание в нем СЖК (мэкв./100 г жира) в качестве теста на степень механической обработки (Van den Berg М. G., 1986).

Активность протеаз. Как было отмечено, активность нативных протеолитических ферментов молока невысока. В то же время психрофильные бактерии, составляющие до 70 % общего количества бактерий сырого охлажденного молока с преобладанием рода Pseudomonas, имеют достаточно высокую протеолитическую активность (табл. 15, с. 101). В результате такого воздействия увеличивается количество продуктов гидролиза белков (γ-казеины, протеозо-пептонная фракция, пептиды, свободные аминокислоты), что отрицательно сказывается на ряде технологических свойств молока. Гидролиз β-казеина, как стабилизирующего фактора мицелл казеина, создает предпосылку неустойчивости белковой фазы молока. Важным обстоятельством является и то, что как нативные, так и микробные протеолитические ферменты молока проявляют достаточно высокую активность при pH, свойственном свежему молоку (6,6...6,7).

В связи с тем что высокое содержание протеолитических ферментов в молоке зависит в основном от количества и активности ферментов микробного происхождения, использование объективного метода определения протеолитической активности сырого молока (с учетом активности нативных протеолитических ферментов) может служить тестом для прогнозирования его стойкости при хранении в части стабильности белковой фазы молока. Величину активности протеолитических ферментов в молоке можно оценивать с различных позиций, поскольку образование к данному моменту в молоке тех или иных продуктов протеолиза характеризует активность различных протеолитических ферментов. Образование в молоке протеозов и пептонов свидетельствует о начальной стадии протеолиза молока, когда протеиназы катализируют разрыв только центральных пептидных связей молекулы белка. Вследствие активности различных аминопептидаз и карбоксипептидаз, которые катализируют гидролиз пептидной связи на концах молекулы белка, в молоке накапливаются различные свободные аминокислоты и пептиды. Дипептидазы, в свою очередь, катализируют расщепление дипептидов до свободных аминокислот. Поэтому накопление в молоке большого количества свободных аминокислот свидетельствует уже о значительной и глубокой степени протеолиза молока.

В связи с указанным, а также в зависимости от цели исследования, протеолитическую активность сырого молока характеризуют по различным продуктам гидролиза белков, определяя соответственно степень «ширины» или «глубины» протеолиза (Глава 4.).

Активность других ферментов. Проявление в сыром молоке активности ряда ферментов, относящихся к различным классам, может вызвать повышение в нем содержания одного и того же вещества. Таким веществом является аммиак. Причиной его повышенного содержания служит активность, например, таких ферментов, как лейциндегидрогеназы, нитритредуктазы, аминоксидазы, D-глутамилтрансферазы, аргининдезаминидазы, уреазы, триптофаназы. Следует отметить, что свежевыдоенное молоко содержит 0,3...0,6 мг% аммиака. Содержание аммиака более 0,85 мг% свидетельствует о плохом качестве молока (Suhren G., 1982). Следовательно, по содержанию аммиака в сыром молоке можно косвенно судить о его качестве, в частности бактериальной обсемененности, поскольку вышеуказанные ферменты имеют в основном микробное происхождение (Шидловская В. П., 1985, 1987).

Вместе с тем показано, что корреляция между содержанием аммиака в сборном молоке (анализ около 160 проб) и средним бактериальным обсеменением – 1,8 · 10⁵ КОЕ/мл недостаточно высока (r = 0,5), в связи с чем содержание аммиака нельзя рассматривать в качестве показателя бактериального качества сырого молока с менее чем 10⁶ КОЕ/мл (Zangeri P., Ginzinger W., 1986).

В части оценки качества молока по его бактериальной обсемененности (особенно гнилостной микрофлоры) представляет интерес определение активности декарбоксилаз аминокислот, которые, катализируя реакции карбоксилирования аминокислот, не только снижают питательную ценность молока, но и вызывают образование аминов, сообщающих молоку не свойственные ему запахи.

Представляет большой практический интерес использование активности липоксигеназы для оценки качества молока. Это обусловлено тем, что фермент вызывает в молоке окисление важнейших питательных и биологически ценных компонентов – полиненасыщенных жирных кислот и некоторых витаминов.

В связи с тем что фосфолипазы снижают биологическую ценность молока, катализируя гидролиз важнейших его компонентов – фосфолипидов, и являются одной из потенциальных причин липолиза молока, представляет интерес применять величину их активности (по убыли фосфолипидов) для оценки качества сырого молока.

Использование величины активности лизоцима для оценки качества молока является также важным, поскольку этот фермент является фактором естественного иммунитета сырого молока и, следовательно, служит достаточно объективным тестом для определения его стойкости при хранении. Содержание в молоке лизоцима и создание условий для более длительного сохранения его активности, например немедленное охлаждение молока после доения, являются важным моментом для возможно дольшего сохранения естественных антибактериальных факторов молока.