ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОБЩЕГО БЕЛКА

В настоящем справочнике под словом "белок" понимается количество общего азота, определенного по Кьель- далю, умноженное на соответствующий коэффициент пересчета, указанный в таблицах. Следует иметь в виду, что метод Кьельдаля позволяет выделять азот в виде аммиака только из аминов и их производных. Некоторые азотсодержащие соединения (нитро-, нитрозо-, азо-соединения и др.) в этих условиях образуют наряду с аммиаком также молекулярный азот, что приводит к получению заниженных данных [22]. Действительно, определение азота по методу Дюма, который не обладает подобным недостатком в некоторых пищевых продуктах, даст завышенные на 1-5% данные по общему азоту по сравнению с методом Кьельдаля.

Однако, несмотря на это, метод Кьельдаля нашел широкое применение в биохимии и при анализе пищевых продуктов. Метод относительно прост, легко поддается автоматизации и, главное, в руках опытного аналитика хорошо воспроизводим (до 1% отн.).

Метод Кьельдаля наиболее подробно описан в классическом руководстве Бредстрита [19) _г где приводятся данные по влиянию различных факторов на точность и длительность анализа. В настоящее время процедура определения общего азота по Кьельдалю стандартизирована в международном масштабе [6,10,11] .

Хотя описание метода вошло в стандарты и во все руководства по технохимическому контролю пищевых продуктов, работы по уточнению некоторых его деталей продолжаются. Так, в работе [20] уточнено количество серной кислоты при сжигании пищевого продукта (4 мл на 1 г углеводов, 5 мл на 1 г белков и 10 мл на 1 г жиров продукта).

Для ускорения определения аммиака используется его фотометрическое определение с реактивом Неслера [9], а для массовых анализов аммиак определяют в чашках Конвея [2]. По-видимому, возможны и другие вариации основного метода. Однако безусловным требованием является предварительная проверка их на известной аминокислоте или нескольких аминокислотах {13] .

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АМИНОКИСЛОТНОГО СОСТАВА

Аминокислотный состав пищевых продуктов определяется в настоящее время исключительно с помощью ионообменной хроматографии. Методы бумажной, тонкослойной хроматографии, микробиологические, газохроматографические и ряд других [I, 2] в настоящее время практически не используются вследствие худшей воспроизводимости и большой длительности. Современные хроматографы позволяют определять аминокислотный состав с воспроизводимостью до 5 % отн. за 2-4 ч.

Однако данные по аминокислотному составу однотипных продуктов, полученных в разных лабораториях по отдельным аминокислотам, иногда различаются до 50 %.

Эти различия объясняются не только сортовыми, видовыми или технологическими различиями, а главным образом условием проведения гидролиза пищевого продукта. При стандартном кислотном гидролизе (6н. НС1, 110-120° С, 22-24 ч) происходит частичное разрушение некоторых аминокислот, в том числе треонина, серина (на 5-10%) и особенно метионина (30-60%) и цистина 56-60% (см., например, работу [14]), а также практически полное разрушение триптофана [16]. Этот процесс усиливается в присутствии больших (более 50% на сухую массу) количеств углеводов в продукте. Несколько уменьшить это разложение можно за счет более сильного разбавления образца серной кислотой (например, вместо 100 мг белка берут 2-5 мг), но границы этого разбавления определяются чувствительностью прибора и в большинстве случаев они не могут быть очень большими. Для количественного определения метионина и цистина рекомендуется проводить предварительное окисление их надмуравьиной кислотой [14, 24]. При этом цистин превращается в цистеиновую кислоту (цветовой выход 1,75), а метионин – в метионин – сульфон (цветовой индекс – 0,8), которые весьма устойчивы при последующем кислотном гидролизе. Окисление проводится по методике, описанной в работах [12, 14], при температуре 4°С в темноте в течение 1-10 ч из расчета 1 мл надмуравьиной кислоты на 2-5 мг белка. Немедленное и тщательное удаление надмуравьиной кислоты после окончания гидролиза (например, в роторе или вакуум-эксикаторе над NaOH) предотвращает потери.

Трудной задачей в аминокислотном анализе является определение триптофана. Как указывалось выше, при кислотном гидролизе происходит почти полное (на 80-90%) его разрушение. Поэтому для определения триптофана проводят один из вариантов щелочного гидролиза, в т. ч. 2 н. NaOH, 100 °С, 16-18 ч в присутствии 5 % хлорида олова или 4 н. Ва(ОН)₂, при которых он разрушается незначительно (до 10%). Минимальное разрушение происходит в присутствии тиогликолевой киряоты или предварительно гидролизов энного крахмала [24]. Гидролизах после соответствующей нейтрализации смесью лимонной и соляной кислот немедленно (во избежание студнеобразования) анализируют на аминокислотном гидролизаторе.

Существуют и другие методы выделения триптофана из чистых белков, в том числе: гидролиз меркаптоэтанолсульфоновой кислотой (27), гидролиз продуктов с Р-толуолсуль фонов ой кислотой, содержащей 3-(2-аминоэтил) -индол; гидролиз 6 н. НС1, содержащей 5 % тиогликолевой кислоты. Описан также ферментный гидролиз с папаином в присутствии 8 М мочевины, 0,005 М тиогликолата, 002 М трилона Б, 0,1 М бората натрия; рН 7,6 [25] Однако подобный гидролиз не дает полного высвобождения триптофана из белков [26].

Что касается многочисленных химических методов определения триптофана [27], то они, как правило, в пищевых продуктах плохо воспроизводимы и поэтому их использовать не рекомендуется.

Для мясных продуктов дополнительной необходимой аминокислотой является оксипролин, который характеризует количество соединительных тканных белков в мясе. Его можно определять ионообменной хроматографией с помощью автоматических анализаторов или химическим колориметрическим методом [13, 15, 23]. Метод основан на нейтрализации кислотного гидролизата до рН 6,0, последующем окислении оксипролина с помощью 1,4% раствора хлорамина Т (или хлорамина Б) в смеси пропилового спирта и буфера и колориметрическом определении при 553 нм продуктов окисления оксипролина после реакции с 10 %-ным раствором шра-диметиламинобензальдегида в смеси хлорной кислоты и пропилового спирта (1:2).

В связи с тем, что тирозин, фенилаланин и пролин в присутствии кислорода могут частично окисляться, стандартный кислотный гидролиз рекомендуется проводить в атмосфере азота [26] .

Следует также учесть, что ряд аминокислот, в том числе лейцин, изолейцин и валин, требуют для своего полного выделения из белков более длительного кислотного гидролиза – до 72 ч.

Поэтому кислотный гидролиз рекомендуют проводить 24, 48, и 72 ч [24], а затем осуществлять интерполяцию на максимальную величину.

Для точного количественного определения всех аминокислот требуется проводить 5 различных гидролизов, что весьма удлиняет определение. Обычно же проводят 1-2 гидролиза (стандартный с соляной кислотой и с предварительным окислением надмуравьиной кислотой).

Во избежание потерь аминокислот удаление избытка кислоты при кислотном гидролизе следует проводить немедленно [1] многократным выпариванием в вакуум-эксикаторе с добавлением деионизированной воды. Следует иметь в виду, что в белках аспарагиновая и глутаминовая кислоты присутствуют в виде амидов, а при кислотном гидролизе происходит их полное выделение из амидов в виде соответствующих аминокислот [8].

При сравнении результатов анализов одних и тех же продуктов по одной и той же методике гидролиза также наблюдаются заметные различия. Вариабельность аминокислотного состава в этих случаях может быть вызвана особенностью конструкции оптической схемы анализатора, нестабильностью состава фирменных растворов стандартов аминокислот и множеством других причин, часть которых указана в литературе [4]. Как правило, это характерно для отдельных аминокислот. Поэтому периодически следует пропускать через анализатор несколько стандартов разных фирм и в сомнительных случаях целесообразно готовить стандартную смесь самостоятельно из чистых аминокислот (для получения однородной смеси ее сначала растворяют, а затем высушивают сублимацией).

При исследовании высокобелковых продуктов отмечалась меньшая вариабельность данных по аминокислотному составу [12] . Из них наименьшей вариабельностью обладает яичный белок [18], коэффициент вариации аминокислотного состава этого продукта у разных исследователей отличается не более чем на 5-10 %.

Поэтому при изучении продуктов животного происхождения для проверки правильности работы рекомендуется периодически проводить анализ яичного белка и сравнивать его с данными, приведенными в настоящем справочнике. При изучении растительных продуктов рекомендуется определять аминокислотный состав стандартного образца пшеницы и сравнивать его с паспортными данными.

При правильной работе анализатора ионообменные колонки работают без замены смолы довольно долго (годы). Однако, если образцы содержат заметные количества красящих веществ и липидов, то колонка быстро забивается и для восстановления ее разделительных способностей требуется многократная регенерация, иногда с перенабивкой колонки.

Поэтому для продуктов, содержащих более 5 % жира (в пересчете на сухие вещества) рекомендуется предварительно удалять липиды экстракцией серным эфиром. Обычно достаточна 2-5-кратная экстракция (в любом экстракторе) гомогенизированного препарата в отношении от 1:5 до 1:10. Использование для удаления липидов этилового спирта, метанола, ацетона, хлороформа или их смесей не рекомендуется, так как в экстракт может перейти часть свободных аминокислот и некоторых фракций белков, что приведет к неправильному представлению об аминокислотном составе продукта.

При анализе сильноокрашенных соков и напитков красящие вещества удаляют обработкой солями свинца или поливинилпирролидоном.

При анализе продуктов повышенной влажности (более 50%) рекомендуется предварительно удалить излишнюю воду как можно более мягким способом (сублимацией, подсушиванием и т. д.).

Если раствор нингидрина недостаточно устойчив, следует через каждые 3-4 анализа прогонять стандартные растворы аминокислот и использовать "внутренний" стандарт, который позволяет дополнительно учитывать ошибки при подготовке проб и проведении гидролиза. В качестве внутреннего стандарта часто используется норлейцин [16]. В случае отсутствия азота для вытеснения кислорода перед гидролизом следует предварительно заморозить смесь в ампуле, откачать под вакуумом из нее воздух и запаять подготовленную таким образом ампулу [ 16, 24].

Продукты относительно богатые белком представляют интерес с точки зрения содержания в них нуклеиновых кислот. Их определение производят по методу, описанному А. С. Спириным [5, 17] .

ВЫЧИСЛЕНИЕ АМИНОКИСЛОТНОГО СКОРА

Биологическая ценность белков пищевых продуктов определяется разными методами, одним из которых является сравнение состава незаменимых аминокислот этого белка с соответствующим аминокислотным составом "идеального" белка. В качестве "идеального" было предложено использовать белок куриного яйца [18], коровьего или женского молока. В настоящее время большинство исследователей используют в качестве "идеального" гипотетический (теоретический) белок, рекомендованный ФАО и ВОЗ в 1973 г. [24] . В 1 г такого белка содержится следующее количество незамешмых аминокислот (в мг) :

Для определения аминокислотного скора какого-либо продукта сначала вычисляют содержание аминокислот в 1 г белка этого продукта. Затем последовательно сравнивают содержание той или иной незаменимой аминокислоты с вышеуказанной стандартной шкалой ФАО/ВОЗ. Лимитирующими являются те незаменимые аминокислоты, скор которых меньше 100 %.

Пример. В 1 г исследуемого белка продукта содержится (в мг): изолейцина – 45, лейцина – 75, лизина – 40, метионина и цистина (в сумме) – 25, фенилаланина и тирозина (в сумме) – 70, треонина – 38, триптофана –11, валина – 50. При сравнении со стандартной шкалой находим, что скоры (в %) соответственно равны: ИЗ, 107, 73, 71, 95, 113, 100.

Следовательно, лимитирующими аминокислотами в данном продукте являются лизин (скор 73 %), сумма метионина и цистина (скор 71 %) и треонин (скор 95 %).

Обычно в справочных таблицах химического состава пищевых продуктов указывают 1 или 2 лимитирующие аминокислоты. В связи с тем, что точность аминокислотного анализа, как отмечалось выше, составляет примерно 5 % отн., то величина скора 95 % и выше приравнивается к 100 % и в настоящем издании таблиц (как и в предыдущем) в подобных случаях в соответствующей графе о наличии лимитирующей аминокислоты ставится слово "Нет". Поэтому в вышеуказанном примере в таблицах должны быть указаны только две лимитирующие аминокислоты – метионин + цистин (скор 71 %) и лизин (скор 73 %).

В настоящем справочнике для всех продуктов, где приводится аминокислотный состав, одновременно указывается коэффициент пересчета азота на белок. Точно установить его чрезвычайно сложно. Более точно он определен для ограниченного числа продуктов. Для большинства же условно принят коэффициент пересчета 6,25. Эта условность вносит иногда кажущееся противоречие между содержанием белка и суммой аминокислот в таблицах. Если фактически коэффициент ниже условного, например 5,30, а пересчет сделан на условный (6,25), то получится завышенное количество белка в продукте и сумма определенных аминокислот может быть меньше данных по содержанию белка в соответствующей графе таблиц. С другой стороны, если фактический коэффициент (например, 6,38) выше условного, то сумма определенных аминокислот может быть выше табличных данных по белку.

К вышеуказанному следует добавить, что сравнение данных по белку и сумме аминокислот осложняется еще двумя обстоятельствами. Первое - это то, что в таблицах, как правило, приводятся данные, полученные на аминокислотных анализаторах по результатам исследования кислотных гидролнзатов продуктов, т. е. после присоединения к аминокислотным остаткам в белке воды. Следовательно, для сравнения суммы аминокислот с содержанием белка необходимо отнять от аминокислот присоединившуюся воду, количество которой варьирует в зависимости от природы аминокислоты.

Второе обстоятельство – наличие в продуктах других аминокислот, кроме указанных в таблицах. Действительно, абсолютное большинство белков состоит из 16 аминокислот и 2 амидов (аспарагина и глю- тамина). Именно они и представлены в таблицах. В высокобелковых продуктах животного и растительного происхождения белки представляют до 90-95 % азотистых веществ. А в низкобелковых продуктах, таких, как овощи, фрукты, ягоды, белки представляют только часть азотистых веществ (например, в винограде 7 %, в картофеле 30 %, капусте 40%). Остальную часть азотистых веществ представляют разнообразные полипептиды, главным образом (20-40 %), свободные аминокислоты. Состав свободных аминокислот в отличие от состава белка сильно варьирует, и в продукте могут в заметных количествах встретиться аминокислоты, не указанные в таблицах (например, ץ-амино- масляная кислота в винограде и продуктах его переработки). В результате в настоящих справочных таблицах для ряда низкобелковых продуктов сумма аминокислот не полностью отражает их фактический аминокислотный состав и может быть меньше данных, представленных в графе, где приведено содержание белка.

Учитывая важность более точного определения аминокислотного состава продуктов, коэффициентов пересчета азота на белок и способов выражения результатов аминокислотного анализа, проведение дальнейших методических работ в этой области весьма актуально.

*   *   *

Важным является также вопрос о вариабельности данных по содержанию белка и аминокислот в пищевых продуктах. На основании материалов, поступивших из отраслевых подкомиссий МВК нами были обобщены данные по вариабельности содержания белков и аминокислот в пищевых продуктах [12]. Вариабельность содержания белка зависит от природы продукта. В животных продуктах коэффициент вариации (относительное среднеквадратичное отклонение) равен 5-10%, для растительных (зерно, бобовые, фрукты) 15-20%. При этом внут- рилабораторная методическая ошибка сходимости (внутрилаборатор ный коэффициент вариации) при определении азота по Кьельдалю, как отмечалось выше, не превышает 1 %. Межлабораторная воспроизводимость (межлабораторный коэффициент вариации) не превышает 2– 3 % (в низкобелковых продуктах выше). Таким образом, общая вариабельность в содержании белка в основном отражает сортовые и видовые особенности продукта, условия выращивания и другие трудноучитываемые причины.

Аминокислотный состав продуктов колеблется значительно шире, чем белковый.

Кроме вариабельности в содержании непосредственно белков, что в той или иной степени отражается на содержании аминокислот, имеет большое значение видовая или сортовая вариабельность аминокислот одного и того же продукта. Кроме того, в отличие от метода определения белков метод определения аминокислот дает значительно большой вклад в общую вариабельность аминокислотного состава. Выше были подробно рассмотрены причины расхождений в аминокислотном анализе, в том числе проведение одного гидролиза вместо пяти, отсутствие анализа стандартных образцов продукта и внешнего стандарта и т. д. В результате в высокобелковых продуктах (мясо, рыба, птица, зерно и зернобобовые) при определении лизина, лейцина, изолейцина, треонина, валина, аргинина, глицина, пролина, серина, гистидина, аспарагиновой и глутаминовой кислот, фенилаланина, аланина, тирозина, общий коэффициент вариации (относительное среднеквадратичное отклонение) равен 10%, при определении метионина – 15 %, триптофана и цистина – 25 % [12]. Для низкобелковых (овощи и фрукт) вариабельность значительно выше – 20, 25 и 30% соответственно [12]. Эти расчеты хорошо совпадают с прямыми экспериментальными данными по межлабораторному испытанию определения состава аминокислот ряда высокобелковых продуктов (казеин, белок яиц, соя, мясо, мука) [28]. Для большинства аминокислот межлабораторный коэффициент вариации находился в пределах 5–10% отн., для цисти – на 11,0-17,6%, метионина – 4,0-16,1%, а для триптофана – 14,3-23,7 %. Следует указать, что на повышенную вариабельность аминокислотного состава низкобелковых продуктов оказывает также влияние то, что аминокислотный состав в них представлен в основном свободными аминокислотами, состав и содержание которых весьма изменчивы. Что касается вариабельности аминокислотного скора, то она значительно (примерно в 2 раза) меньше, поскольку он рассчитывается из расчета на 1 г белка и поэтому колебание на содержание белка в продукте на его величину не влияет.