Изучение химического состава пищевых продуктов, определение их пищевой и биологической ценности наряду с другими показателями предусматривает получение данных о содержании в них витаминов.

Незаменимые вещества пищи, объединяемые под общим названием "витамины", относятся к различным классам химических соединений, что само но себе исключает возможность использования единого метода их количественного определения. Все известные для витаминов аналитические методы основаны либо на определении специфических биологических свойств этих веществ (биологические, микробиологические, ферментативные методы), либо на использовании их физико-химических характеристик (флюорометрические, хроматографические и спектрофотометрические методы), либо на способности некоторых витаминов вступать в реакцию с некоторыми реагентами с образованием окрашенных соединений (колориметрические методы).

Несмотря на достигнутые успехи в области аналитической и прикладной химии методы определения витаминов в пищевых продуктах еще трудоемки и длительны. Это обусловлено рядом объективных причин, основные из которых следующие.

Определение ряда витаминов часто осложняется тем, что многие из них находятся в природе в связанном состоянии в виде комплексов с белками или пептидами, а также в виде фосфорных эфиров. Для количественного определения необходимо разрушить эти комплексы и выделить витамины в "свободном" виде, доступном для физико-химического или микробиологического анализа. Это достигается обычно путем использования особых условий обработки (кислотным, щелочным или ферментативным гидролизом, автоклав и ров а ни ем и г. д.).

Почти все витамины – соединения весьма неустойчивые, легко подвергающиеся окислению, изомеризации и полному разрушению под воздействием высокой температуры, кислорода воздуха, света и других факторов. Эти процессы могут в значительной степени ускоряться в результате нарушения целостности клеточных структур при гомогенизации тканей, освобождении и активизации ферментов, содержащихся в самих исследуемых объектах. Для предохранения витаминов от разрушения в процессе анализа следует соблюдать меры предосторожности: максимально сокращать время на предварительную подготовку продукта, избегать сильного нагрева и воздействия света, использовать антиоксиданты и т. д.

Наконец, еще одно непременное условие, которое необходимо соблюдать при определении витаминов. В пищевых продуктах, как правило, приходится иметь дело с группой соединений, имеющих большое химическое сходство и одновременно различающихся по биологической активности. Например, витамин Е включает 8 токоферолов, весьма сходных по химическим свойствам, но в то же время отличающихся по биологическому действию; группа каротинов и каротиноидных пигментов насчитывает до 80 соединений, из которых только 10 в той или иной степени обладают витаминными свойствами. Кроме этого, анализ затрудняет присутствие в исследуемом образце сопутствующих веществ, количество которых может во много раз превышать содержание определяемого витамина (например, стерины и витамин D).

Для устранения возможных погрешностей при определении витаминов в пищевых продуктах обычно проводят тщательную очистку экстрактов от сопутствующих соединений и концентрирование витамина. Это достигают, используя различные приемы: осаждение мешающих анализу веществ, методы адсорбционной, ионообменной или распределительной хроматографии, избирательную экстракцию определяемого соединения и т. д.

В последние годы для определения витаминов в пищевых продуктах с успехом стали использовать метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Этот метод является наиболее перспективным, так как позволяет одновременно разделять, идентифицировать и количественно определять различные витамины и их биологически активные формы. ВЭЖХ значительно сокращает время проведения анализа и, по-видимому, постепенно будет вытеснять трудоемкие и длительные методы анализа.

В настоящее время известно большое количество методов определения каждого витамина, в одних случаях принципиально различных между собой, в других имеющих одну общую основу и различающихся лишь в деталях. Многообразие рекомендаций затрудняет выбор метода, наиболее пригодного для конкретного случая, а использование методов, отличающихся по специфичности, чувствительности и точности, может привести к получению результатов, существенно различающихся между собой. Следовательно, успех исследования зависит от того, насколько правильно выбран метод анализа, наиболее соответствующий каждому случаю.

Изложенное выше имело цель подчеркнуть основные трудности, с какими обычно сталкиваются при определении витаминов в пищевых продуктах и недооценка значимости которых может привести к серьезным погрешностям при анализе.

Предлагаемые рекомендации по методам определения витаминов составлены на основании обобщения литературных данных и экспериментальной сравнительной оценки различных методов, проведенной в Институте питания АМН СССР применительно к отдельным видам пищевых продуктов.

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Эти методы основаны на использовании физико-химических характеристик витаминов (их способности к флюоресценции, светопоглошению, окислительно-восстановительным реакциям и пр). Благодаря развитию аналитической химии, приборостроения физико-химические методы почти полностью вытеснили длительные и дорогостоящие биологические методы анализа. Ниже рассмотрены основные из них.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИТАМИНА С

 Витамин С (аскорбиновая кислота) может присутствовать в пищевых продуктах как в восстановленной, так и в окисленной форме. Дегидроаскорбиновая кислота может образовываться при обработке и хранении пищевых продуктов в результате окисления, что вызывает необходимость ее определения. Кроме того, наряду с витамином С в некоторых продуктах могут присутствовать вещества, способные вступать во взаимодействие с используемыми реагентами и влиять на результаты анализа. Следовательно, используемые методы должны обеспечивать определение как восстановленной, так и окисленной формы аскорбиновой кислоты и исключать влияние сопутствующих и мешающих анализу соединений.

При определении витамина С в пищевых продуктах используют различные методы: колориметрические, флюорометрические, методы объемного анализа, основанные на окислительно-восстановительных свойствах аскорбиновой кислоты, и ВЭЖХ.

При взаимодействии аскорбиновой кислоты с диазотарованным 4-метокси-2-нитроанилином в щелочной среде образуется соединение голубого цвета, концентрацию которого определяют колориметрически [67, 79]. Метод обладает достаточно высокой специфичностью. Установлено, что ионы железа, сульфиты и редуцирующие вещества в концентрациях, в 2 раза превышающих содержание аскорбиновой кислоты, не мешают определению [78] . Однако из-за недостаточной чувствительности этот метод не нашел широкого применения в аналитической практике.

Для суммарного и раздельного определения окисленной и восстановленной форм аскорбиновой кислоты часто используют метод Роэ [76, 77] с применением 2,4-динитрофенилгидразинового реактива. Использование этого метода для определения витамина С в ряде пищевых продуктов проверено путем сравнения его с другими методами [31]. При определении в таких продуктах, как консервы, сушеные овощи и фрукты, продукты с большим содержанием Сахаров отмечена недостаточная точность. Было показано, что при определении витамина С по реакции с 2,4-динитрофенилгидразином анализу мешают редуктоны, редуктоновая кислота, сахароза, глюкоза, фруктоза, гликоген и некоторые другие вещества. Поэтому при большом содержании Сахаров в исследуемом продукте для повышения точности метода приходится использовать хроматографию в тонком слое адсорбента [80, 87], что значительно осложняет определение.

В последнее время для определения общего содержания витамина С (суммы аскорбиновой и дегидроаскорбиновой кислот) получил признание весьма чувствительный и точный флюорометрический метод. Дегидроаскорбиновая кислота, конденсируясь с о-фенилендиамином, образует флюоресцирующее соединение хиноксамин, обладающее максимальной флюоресценцией при длине волны возбуждающего света 350 нм. Флюоресценция излучаемого света находится в области 430 нм [41, 71]. Установлено, что интенсивность флюоресценции в нейтральной среде при комнатной температуре прямо пропорциональна концентрации дегидроаскорбиновой кислоты. Для количественного определения аскорбиновой кислоты ее предварительно окисляют в дегидроаскорбиновую кислоту. Метод высок о специфичен, так как развитие посторонней флюоресценции тормозится образованием комплекса с борной кислотой. Широкое внедрение этого метода в аналитическую практику сдерживается отсутствием сие ктро флюоро метров.

Из методов, основанных на окислительных свойствах аскорбиновой кислоты, наибольшее применение нашел метод титрования раствором 2,6-дихл о р фенол индофенол а [89] . Он прост в выполнении, а в сочетании с определенными приемами обработки обеспечивает получение достаточно точных результатов и может быть использован при анализе всех видов пищевых продуктов. Наиболее простым вариантом этого метода является визуальное титрование, которое используют для определения аскорбиновой кислоты в свежих овощах и фруктах, не содержащих естественных пигментов, в картофеле, молоке и некоторых других объектах [26].

При анализе продуктов, содержащих естественные красители, определение проводят методом электрометрического титрования раствором 2,6-дихлорфснолиндофенола [5] или способом индофенол- кеилоловой экстракции [3] . При анализе консервированных пищевых продуктов титрование проводят после восстановления дегидроаскорбиновой кислоты в аскорбиновую цистеином. Дня устранения влияния редуктоно в и других редуцирующих примесей экстракты обрабатывают формальдегидом [6,7] .

Для определения витамина С во всех пищевых продуктах с успехом может быть использован высокочувствительный и специфичный метод ВЭЖХ [29, 63] . Определение аскорбиновой кислоты методом ВЭЖХ во фруктовых и овощных соках несложное. Образцы лишь разводят экстрагирующим раствором до получения конечной концентрации в пределах стандартной кривой. Подходящим растворителем является метанол или 6 %-ный раствор метафосфорной кислоты [66]. При анализе продуктов, богатых белками, необходимо их предварительно удалить [66]. Ионы металлов не мешают определению аскорбиновой кислоты методом ВЭЖХ. Детектирование обычно проводят но флюоресценции [83, 95] .

Одним из ответственных моментов количественного определения витамина С любым из перечисленных методов является приготовление экстракта образца. Эта стадия анализа должна обеспечивать полное извлечение аскорбиновой кислоты при минимальном ее окислении. Известно, что наилучшим экстрагентом является 6 %-ный раствор метафосфорной кислоты, обладающий способностью осаждать белки и инактивировать оксидазу аскорбиновой кислоты. При извлечении аскорбиновой кислоты из объектов, содержащих ионы металлов (консервированные продукты, хранимые в нелакированной таре), хорошие результаты получаются при добавлении в экстрагирующий раствор этилен диаминтетрауксусной кислоты (ЭДТЛ), которая образует комплексы с металлами [73] .

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТИАМИНА

В большинстве природных источников тиамин встречается в виде дифосфорпого эфира – кокарбокси- лазы. Последняя, являясь активной группой ряда ферментов углеводного обмена, находится в определенных связях с белком. Для количественного определения тиамина необходимо разрушить комплексы и выделить исследуемый витамин в свободном виде, доступном для физико-химического анализа. Освобождение тиамина из связанного состояния обычно осуществляют с помощью кислотного гидролиза и под воздействием фосфатазных и протеолитических ферментов. В качестве источника фосфатаз используют различные ферментные препараты; такадиаетаэу, амилоризин П10Х, фосфаморин [13, 21], При рН 4,5 под действием амилаз, содержащихся в этих ферментных препаратах, одновременно происходит и расщепление крахмала, который, адсорбируя на себе витамины, мешает их количественному определению.

Объекты, богатые белком, предварительно подвергают обработке протеолитически ми ферментами (пепсином) в среде 0,1 н, раствора соляной кислоты [21] . При анализе продуктов, содержащих большое количество пектиновых веществ (некоторые плоды, ягоды и др.), хорошие результаты дает гидролиз с лектаваморином П10Х. Объекты с высоким содержанием жира (жирное мясо, свинина, колбасные изделия, мясные консервы, сыры, молочные продукты с высоким содержанием жира и др.) для его удаления обрабатывают эфиром. Поскольку тиамин в эфире практически нерастворим, потерь его при этом не происходит.

Для определения тиамина в пищевых продуктах используют, как правило, флюорометрический метод [21, 101J, основанный на окислении тиамина в щелочной среде феррицианидом калия с образованием сильно флюоресцирующего в ультрафиолетовом свете соединения – тиохрома. Интенсивность флюоресценции последнего прямо пропорциональна содержанию тиамина.

Флюорометрическое определение тиамина часто затрудняется присутствием в ряде объектов соединений, также обладающих флюоресценцией. Эти примеси, маскируя флюоресценцию тиохрома, искажают результаты анализа и делают невозможным проведение определения без специальных обработок проб. Мешающие вещества удаляют очисткой на колонках с ионообменными смолами (катионит СДВ-3, КУ-2, сильнокислотные сульфосмолы марки КРС-1п и КРС-ЗпТ40 с размером частиц 0,5-1,0 мм) . Многие объекты (молоко, мясо, картофель, некоторые овощи, пшеничный хлеб и др.) содержат незначительное количество флюоресцирующих примесей, поэтому при их анализе нет необходимости употреблять адсорбциошше колонки. В этом случае флюоресцирующие соединения удаляются из экстракта встряхиванием с изобутиловымили бутиловым спиртом [13, 18, 21].

При необходимости одновременного определения содержания в продукте тиамина и рибофлавина первый этап исследования – кислотный и ферментативный гидролиз – можно проводить по общей схеме [22] .

Дли одновременного определения тиамина и рибофлавина в последние годы наибольшее признание получил метод ВЭЖХ [58, 99] . Он имеет много преимуществ по сравнению с другими общепринятыми методами: позволяет одновременно разделять, идентифицировать и количественно определять витамины группы В при значительном сокращении времени, затрачиваемого на анализ. Метод ВЭЖХ с успехом используют для определения тиамина и рибофлавина в обогащенных этими витаминами пищевых продуктах [33, 57, 65] .

ОПРЕДЕЛЕНИЕ РИБОФЛАВИНА

В пищевых продуктах рибофлавин присутствует главным образом в виде фосфорных эфиров: флавинмононуклеотида (ФМН) и флавинадениндинуклеотида (ФАД). Оба соединения связаны с балками и не могут быть определены без предварительного протеолитического расщепления. Свободный рибофлавин в значительном количестве содержится в молоке.

При определении общего содержания рибофлавина в естественном материале наибольшее распространение получили микробиологический и физико-химический (флюорометрический) методы анализа. Микробиологический метод с использованием тест-организма Lactobacillus casei А ТСС 7469 обладает достаточной специфичностью, высокой чувствительностью и точностью и применим практически ко всем объектам. В то же время метод длителен и требует специальных условий.

Свободный рибофлавин, ФМН и ФАД обладают характерной желто- зеленой флюоресценцией при облучении их светом с длиной волны 440-500 нм. На этом свойстве основан наиболее широко используемый флюорометрический метод определения рибофлавина. Все три соединения дают очень сходные спектры флюоресценции с максимумом при длине волны 530 нм. Положение максимума не изменяется при изменении рН, хотя интенсивность флюоресценции в значительной степени зависит от растворителя и величины рН. Свободный рибофлавин и ФМН показывают максимальную флюоресценцию при рН 6,0-7,0, в то время как ФАД при этих условиях - только 10-15% флюоресценции. Последнее соединение дает максимальную флюоресценцию при рН 2,9. В связи с этим при определении общего содержания рибофлавина в пищевых продуктах прибегают к таким способам обработки, которые разрушают флавиннуклеотидный комплекс, в результате чего образуется свободный рибофлавин [72] .

Существует много различных способов гидролиза и экстракции рибофлавина из образца. Так, для освобождения связанного с белком рибофлавина и превращения ФМН и ФАД в свободный рибофлавин используют автоклавирование, гидролиз с соляной или трихлоруксусной кислотами, обработку ферментными препаратами такадиастазой, папаином, пепсином, амилоризином П10х или пектаваморином П10х [22, 72] . Метод ВЭЖХ дает возможность при необходимости проводить раздельное определение рибофлавина, ФМН и ФАД в пищевых продуктах [64, 40] .

Поскольку рибофлавин легко разрушается на свету, определение проводят в защищенном от света месте. Следует поддерживать рН растворов не выше 7,0, так как рибофлавин в щелочной среде быстро разрушается. К действию кислот он относительно устойчив.

Физико-химический метод разработан и применяется в двух вариантах, которые различаются способом оценки количества флюоресцирующих веществ. Вариант прямой флюорометрии [22, 72] основан на определении интенсивности рибофлавина до и после его восстановления гидросульфитом натрия. Люмифлавиновый вариант использует свойство рибофлавина при облучении в щелочной среде переходить в люмифлавин, интенсивность флюоресценции которого измеряют после извлечения его хлороформом [22, 86] .

На флюоресценцию рибофлавина влияет целый ряд факторов. Линейная зависимость между концентрацией рибофлавина и его флюоресценцией сохраняется при концентрации рибофлавина ниже 1 мкг/мл. При более высоких концентрациях происходит самогашение флюоресценции и линейная зависимость нарушается. Флюоресценция может меняться от присутствия различных пигментов и анионов, таких, как галоиды, цианиды, тиоцианиды, сульфиты и нитриты. Кроме того, на нее влияют другие флюоресцирующие вещества, которые часто присутствуют в экстрактах естественных материачов.

Для удаления мешающих пигментов обычно используют быстрое окисление перманганатом калия. Избыток перманганата затем разрушают добавлением перекиси водорода. Следует иметь в виду, что в присутствии солей железа обработка перекисью водорода приводит к быстрому разрушению рибофлавина. Разрушение может быть предотвращено путем удаления железа до окисления добавлением фосфорной кислоты и отфильтровывания образующего осадка при рН 4,5- 6,6. Хорошие результаты дает осаждение белков при изменении рН фильтрата до 6,0-6,5, а затем до 4,5.

Для повышения специфичности метода прямой флюорометрии используют свойство рибофлавина восстанавливаться в нефлюоресцирующее соединение под действием гидросульфита натрия, в то время как мешающие пигменты и посторонние флюоресцирующие вещества ими не восстанавливаются.

Метод прямой флюорометрии неприменим к объектам с очень низким содержанием рибофлавина (некоторые овощи, плоды, ягоды), с высоким уровнем железа, и к тем продуктам, у которых нагревание приводит к реакции меланоидинообразования. В этих случаях, а также при исследовании зерновых продуктов (круп, муки, зерна, хлеба и т. д.) более предпочтительным является люмифлавиновый метод.

Образование люмифлавина из рибофлавина идет количественно при облучении в щелочной среде и концентрации последнего не более 2,4 мкг/мл. Поскольку при определенных условиях в люмифлавин переходит 60-70 % общего рибофлавина, при проведении анализа необходимо соблюдать постоянные условия облучения, одинаковые для испытуемого и стандартного раствора. В этом случае предпочтительнее использовать способ введения внутреннего стандарта [13, 72,86].

Предварительная (до фотолиза) обработка испытуемого экстракта хлороформом позволяет удалить из раствора посторонние флюоресцирующие вещества, растворимые в хлороформе, и тем самым повысить специфичность метода.

Подробное описание люмифлавинового метода приводится в литературе [22, 86].

ОПРЕДЕЛЕНИЕ НИАЦИНА

В пищевых продуктах никотиновая кислота и ее амид находятся как в свободной, так и в связанной форме, входя в состав коферментов (НАД и НАДФ) ряда важнейших ферментов окислительного превращения. Существующие химические и микробиологические методы количественного определения ниацина предполагают наиболее полное выделение и превращение его связанных форм, входящих в состав сложного органического вещества клеток, в свободную никотиновую кислоту. Связанные формы ниацина освобождают воздействием растворов кислот или гидроксида кальция при нагревании. Существует много рекомендаций, касающихся условий обработки, вида и концентрации применяемого реагента. Для этих целей используют автоклавирование или нагревание на кипящей водяной бане с растворами соляной и серной кислот [30, 48] или с Са(ОН)₂ [49].

Сравнительные анализы пищевых продуктов, проведенные с использовавшем указанных реактивов, показали, что гидролиз с 2 н. раствором серной кислоты в автоклаве в течение 30 мин при давлении 0,1 МПа приводит к полному освобождению связанных форм ниацина и превращению никотинамида в свободную никотиновую кислоту. Установлено, что этот способ обработки дает менее окрашенные гидролизаты и может быть использован при анализе мясных и рыбных продуктов [23].

Гидролиз с Са(ОН)₂ более предпочтителен при определении ниацина в муке, крупах, хлебобулочных изделиях, сырах, сухих молочных продуктах, пищевых концентратах, овощах, ягодах и фруктах. Гидроксид кальция образует с сахарами и полисахаридами, пептидами и гликопептидами соединения, почти полностью нерастворимые в охлажденных растворах, В результате экстракт, полученный при обработке Са (OH)₂, содержит меньше веществ, мешающих химическому определению, чем кислотный гидролизат. Тем не менее и при этом способе гидролиза в фильтрате всегда присутствуют в большем или меньшем количестве посторонние окрашенные вещества, мешающие колориметрическому анализу, а также соединения, способные вступать во взаимодействие с реактивами с образованием окрашенных продуктов. Чтобы уменьшить влияние этих веществ, используют обработку гидролизата концентрированным раствором сульфата цинка. При добавлении к смеси раствора едкого натра образуется желатинообразный осадок Zn(OH)₂, который удаляет из раствора многие тины веществ (белки, сахара, дубильные вещества и др.) и является хорошим очищающим агентом. Этот способ очистки весьма прост, достаточно эффективен и рекомендован для применения Ассоциацией химии витаминов [48] .

В основе химического метода определения ниацина лежит реакция, предложенная Кениг, протекающая в две стадии. Первая стадия - реакция взаимодействия пиридинового кольца никотиновой кислоты с бромцианом, вторая – образование окрашенного производного глутаконового альдегида в результате взаимодействия с ароматическими аминами. Позднее бромциановый реактив был заменен менее токсичным бромродановым [23].

Существует много модификаций проведения этой реакции, касающихся условий температурного режима, влияния рН среды, источника ароматических аминов, постановки контрольных опытов для внесения поправки на возможное присутствие мешающих веществ и т. д. Наиболее существенные из них касаются источников ароматических аминов, так как интенсивность и устойчивость развивающейся окраски зависит в первую очередь от природы ароматического амина и рН среды. Наиболее устойчивую окраску дают продукты реакции взаимодействия никотиновой кислоты с бромродановым (бромтщановым) реактивом и сульфаниловой кислотой или метолом (сульфатом пара-метиламинофенола) [23, 43].

Эти источники ароматических аминов рекомендованы для использования при определении ниацина Ассоциацией химии витаминов [48] и Ассоциацией аналитической химии [13] ,

Для количественного определения ниацина широко используют также микробиологический метод с тест-организмом Lactobacillus plantaruni АТСС 8014 [13, 23]. Метод простой, специфичный, по более длительный, чем химический. Микробиологический метод позволяет определять содержание ниацина в объектах в которых химическим путем это сделать невозможно (продукты с высоким содержанием сахароз и с низким уровнем ниацина). С целью стандартизации и упрощения микробиологического метода Чехословацким институтом по изготовлению сывороток и прививочных веществ (Прага) разработана и выпускается сухая питательная среда для определе!шя ниацина с тест-организмом Lactobacillus plantarum АТСС 8014. Проведенное сравнение микробиологического метода с методом ВЭЖХ для определит я ниацина в пищевых продуктах показало широкие возможное™ последнего и его несомненные преимущества при исследовании обогащенных продуктов [66,38].

ОПРЕДЕЛЕНИЕ β-КАРОТИНА

Большинство применяемых в настоящее время физико-химических методов определения β-каротина в пищевых продуктах основано на измерении интенсивности светопоглощения его растворов. Как соединения с сопряженными двойными связями, каротиноиды имеют характерные спектры поглощения в ультрафиолетовой и видимой области. Положение полосы поглощения каротиноидов зависит от числа сопряженных двойных связей в их молекуле. Увеличение этого числа влечет за собой значительное возрастание максимума поглощения, который зависит также и от используемого растворителя. Так, максимальное поглощение β-каротин а наблюдается в бензоле при длинах волн 464-465 им. в циклогексане при 454-455, в петролейном эфире и гексане при 450-451 нм [1] .

В пищевых продуктах наряду с (3-каротином обычно присутствуют и другие каротиноиды. Некоторые из них (α и β-каротин, кринтоксан тин и др.) являются провитаминами (предшественниками) витамина А, так как в организме человека и животных могут превращаться в витамин А. Известно около десяти провитаминов А; самым активным из них является β-каротин.

При анализе пищевых продуктов необходима предварительная обработка образца для извлечения, концентрирования каротина и очистки его от сопутствующих соединений. В этих целях широко используют экстракцию, омыление, хроматографию.

Наиболее эффективными растворителями для экстракции каротина являются петролейный эфир, гексан, ацетон и их смеси; они разрывают белково-каротиновый комплекс и извлекают каротин. Для объектов, богатых каротином, лучшим экстрагентом служит смесь гексана и ацетона в соотношении 1:1. При экстракции тканей, бедных каротином, желательно увеличение доли ацетона в смеси. Хорошие результаты дает применение смеси петролейного эфира и ацетона в соотношении 2:1. Для предохранения от фотохимического распада β-каротина экстракцию проводят по возможности быстро с добавлением антиоксиданта (аскорбиновой кислоты).

При определении 0-каротина желательно избегать нагревания. Но в некоторых случаях горячее омыление необходимо, например, когда отношение жира к каротину в объектах больше чем 1000:1. В этих случаях омыление проводят под азотом в присутствии антиоксиданта. Горячему омылению подвергают молочные продукты, животные жиры, маргарин, яйца, печень. При этом количество добавляемой щелочи должно обеспечивать полное омыление жира, но одновременно не быть слишком высоким, так как избыток щелочи может привести к разрушению витамина А и каротина, особенно при низком содержании их в продукте.

Количество щелочи, рекомендуемое для проведения гидролиза, в одних случаях равно половине массы образца [13] , в других – половине массы жира в навеске образца [4]. Последние рекомендации более обоснованы, так как соотнесены с количеством жира, который подвергают гидролизу. Однако полнота омыления зависит также и от других составных частей исследуемого продукта и условий проведения гидролиза. Поэтому для каждого вида продукта желательно подбирать оптимальные условия обработки.

Определение /3-каротина в присутствии других каротиноидов является главной задачей следующей стадии анализа. Для отделения /3-каротина от сопутствующих пигментов широко применяют адсорбционную хроматографию, реже – распределительную. Оба вида хроматографии могут быть проведены с использованием колонок или пластинок с тонким слоем адсорбента. Тонкослойная хроматография обеспечивает хорошее разделение и применяется для идентификации каротиноидов. Однако ее использование в количественном анализе сдерживается быстрым окислением и изомеризацией каротиноидов в тонком слое адсорбента.

Всеобщее признание для разделения смеси каротиноидов в количественном анализе завоевала адсорбционная хроматография на колонках с окисью алюминия, окисью магния, смесью окиси магния и силикагеля [13]. Четкость хроматографического разделения пигментов на колонке зависит от многих факторов: активности адсорбента, размера колонки, количества пигментов, присутствия других компонентов в разделяемой смеси.

Важнейшей характеристикой выделенного β-каротина и других каротиноидов остаются их спектры поглощения. Для контроля чистоты отделения β-каротина от других каротиноидов снимают спектр поглощения β-каротина в гексане или петролейном эфире в диапазоне от 430 до 480 нм. Получение четких максимумов при длинах волн 450 и 475 нм и минимума при 465 нм свидетельствует о хорошем отделении β-каротина от других каротиноидов.

Для расчета содержания β-каротина в испытуемом образце пользуются специфическим показателем удельного поглощения (Е^1%_1см ) или калибровочным графиком, построенным при использовании растворов кристаллического β-каротина.

В течение последнего десятилетия значительные успехи достигнуты в развитии метода ВЭЖХ, который позволяет анализировать сложные природные смеси соединений, имеющих сходные химические и физические характеристики, таких, как витамин А и каротиноиды. Применение современной техники ВЭЖХ значительно снижает затраты времени (до 60 мин) для разделения и количественного определения этих соединений в экстрактах пищевых продуктов [66, 91 ] . Такой быстрый анализ до минимума сокращает время, в течение которого каротиноиды и витамин А подвергаются разрушающему воздействию света и кислорода воздуха и, следовательно, обеспечивает получение более точных результатов.

Метод ВЭЖХ каротиноидов [34] является классическим примером демонстрации возможностей этого метода разделять и количественно определять пространственные изомеры α- и β-каротина в овощах. Этот метод был использован для изучения каротинов в пищевых продуктах и изучения влияния различных способов обработки на превращение полного транс-изомера каротина в цис-изомер [88] . Различные варианты метода ВЭЖХ описаны для фруктов и овощей [34, 88], плодов цитрусовых и цитрусовых соков [70] , для разделения и количественного определения ликопина и каротина в томатах [93].

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИТАМИНА А

При количественном определении витамина А в пищевых продуктах используют различные методы: колориметрический, флюорометрический, способ прямой спектрофотометрии и ВЭЖХ. Выбор метода определяется наличием той или иной аппаратуры, целью исследования, свойствами анализируемого материала, предполагаемым содержанием витамина А и характером сопутствующих примесей.

Для количественного определения веществ, обладающих А-вита- минной активностью, может быть использован метод прямой спектрофотометрии, основанный на способности этих соединений к избирательному светопоглощению на разных длинах волн в -ультрафиолетовой области спектра. Поглощение пропорционально концентрации вещества при измерении на тех длинах волн, где наблюдается свойственный данному соединению максимум абсорбции в используемом растворителе. Метод прямой спектрофотометрии наиболее простой, быстрый, достаточно специфичный. Он дает надежные результаты при определении витамина А в объектах, не содержащих примесей, обладающих поглощением в той же области спектра. При наличии посторонних веществ метод может быть использован в сочетании со стадией хроматографического разделения. Методом прямой спектрофотометрии витамин А можно определить только в том случае, если отношение поглощения его растворов при длинах волн 310 и 325 нм < 1. В этом случае для расчета содержания витамина А используют величину поглощения при 325 нм [13].

Перспективным является флюорометрический метод, основанный на способности ретинола флюоресцировать под действием ультрафиолетовых лучей при длине волны возбуждающего света 330–360 нм. Возникающая флюоресценция имеет максимум в области 480 нм. К соединениям, мешающим определению витамина А флюорометрическим методом, относятся каротиноиды, витамин D, фитофлуен. Для устранения мешающего влияния этих соединений предложено использовать поправку на фитофлуен и проводить хроматографическую очистку, используя оксид алюминия [45, 46] . Практическое применение флюорометрического метода для анализа пищевых продуктов возможно только при наличии спек трофлюорометров или флюорометров, укомплектованных светофильтрами с узким диапазоном пропускания в указанных областях спектра.

Наиболее широкое распространение получил колориметрический метод определения витамина А по реакции с хлоридом сурьмы [35]. Эта реакция для витамина А не специфична, аналогичное окрашивание с хлоридом сурьмы дают каротиноиды, но хроматографическое разделение этих соединений позволяет устранить их мешающее влияние. Существенным недостатком метода является неустойчивость развивающейся окраски, которая затрудняет оценку величины оптической плотности растворов. Измерение оптической плотности проводят при длине волны 620 нм в течение 3-5 с [4, 13] .

Определению витамина А перечисленными методами, как правило, предшествует подготовительная стадия, включающая щелочной гидролиз жироподобных веществ (см. определение /3-каротина) и экстракцию неомыляемого остатка органическим растворителем. Многие пищевые продукты содержат вещества, которые, подобно каротиноидам, вместе с витамином А переходят в неомыляемую фракцию и мешают спектрофотометрическому, флюорометрическому и колориметрическому определению. В таких случаях проводят хроматографическое отделение витамина А от сопутствующих соединений, используя колонки с оксидом алюминия (активированный, влажностью 4 %), оксидом магния, кизельгелем и др. [4] . При наличии большого количества мешающих анализу веществ иногда необходимо повторить хроматографическую очистку на колонках с подбором адсорбентов, обладающих различными поглощающими свойствами [13].

В последнее время вместо колоночной хроматографии находит все более широкое применение ВЭЖХ, которая позволяет разделить жирорастворимые витамины (A, D, Е, К), обычно присутствующие одновременно в пищевых продуктах, и количественно их определить с большей точностью. ВЭЖХ облегчает возможность определения различных форм витаминов (витамин А-спирт, его изомеры, эфиры ретинола и родственные соединения), что особенно необходимо при контроле за внесением витаминов в пищевые продукты [61, 84, 97] . Метод ВЭЖХ с успехом был применен для определения ретинилпальмитата в обогащенных продуктах, таких, как сухие завтраки, молоко и молочные продукты, маргарин [59, 61] .

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИТАМИНА Е

 К группе веществ, объединяемых общим названием "витамин Е", в соответствии с принятой номенклатурой относятся производные токола и токотриенола, обладающие биологической активностью а-токоферола. Кроме α-токоферола, известно еще семь родственных ему природных соединений, обладающих биологической активностью. Все они могут встречаться в пищевых продуктах. Следовательно, при определении витамина Е в продуктах питания основная трудность состоит в том, что во многих случаях приходится рассматривать группу соединений, имеющих большое химическое сходство, но одновременно различающихся по биологической активности, оценить которую можно только биологическим методом. Однако в силу длительности биологических исследований, их большой трудоемкости и высокой стоимости они почти полностью вытеснены физико-химическими методами.

Применяемые в настоящее время методы определения витамина Е в пищевых продуктах включают следующие основные стадии: подготовку образца, щелочной гидролиз жиров (омыление), экстракцию неомыляемого остатка органическим растворителем, отделение витамина Е от мешающих анализу веществ и разделение токоферолов с помощью различных видов хроматографии, количественное определение.

Токоферолы весьма чувствительны к окислению в щелочной среде, поэтому омыление и экстракцию неомыляемого остатка проводят в атмосфере азота и в присутствии антиоксиданта (аскорбиновой кислоты). Эти условия обработки являются достаточными для насыщенных токоферолов (токолов), но не всегда обеспечивают необходимую сохранность ненасыщенных форм (токотриенолов), которые более подвержены разрушению. В связи с этим при необходимости определения всех форм витамина Е, содержащихся в продукте, омыление заменяют другими видами обработки, например кристаллизацией при низких температурах [37].

Большинство физико-химических методов определения витамина Е основано на использовании окислительно-восстановительных свойств токоферолов. Для определения суммы токоферолов в пищевых продуктах наиболее часто используют широко известную реакцию восстановления трехвалентного железа в двухвалентное токоферолами с образованием окрашенного комплекса двухвалентного железа с а, а-дипи- ридилом или батофенантролином, обладающего максимумом поглощения при 520 нм [44]. К сожалению, реакция не является строго специфичной для токоферолов, окрашенные комплексы с указанными реактивами могут давать каротины, стеролы, витамин А и некоторые другие соединения. Кроме того, интенсивность образования окрашенного продукта существенно зависит от длительности экспозиции, температуры, освещения и других факторов. Поэтому для повышения точности анализа токоферолы предварительно отделяют от соединений, мешающих определению. Для этой цели используют колоночную хроматографию [8, 9], хроматографию в тонком слое адсорбента [16, 19Г, газожидкостную хроматографию [19,75] иВЭЖХ [42,92].

Для отделения токоферолов от веществ, мешающих при колориметрическом определении (каротиноиды, витамин А), наибольшее распространение получила колоночная хроматография на оксиде алюминия. Для элюции токоферолов используют различные системы растворителей: ацетон-гексан [100], этиловый спирт-циклогексан [8, 39] и др. При выборе системы растворителей и условий для элюции токоферолов проверяют полноту отделения токоферолов от мешающих соединений. Одним из способов такой проверки служит хроматография в тонком слое адсорбента.

При определении Е-витаминной ценности продуктов, в которых α-токоферол составляет более 80 % общего содержания токоферолов (мясо, мясопродукты, молоко и молочные продукты, рыба и др.), можно ограничиться определением суммы токоферолов. В тех же случаях, когда кроме α-токоферола в продуктах в значительных количествах присутствуют другие токоферолы (растительные масла, зерно и продукты его переработки, хлебобулочные изделия, орехи и др.) „ для их разделения используют хроматографию на колонках [15].

Для определения индивидуальных токоферолов несомненный интерес представляет метод ВЭЖХ [81, 92] , обеспечивающий в одном процессе как разделение, так и количественный анализ. Его высокая чувствительность и точность дают возможность получить надежные результаты в тех случаях, когда другие методы мало пригодны. Метод ВЭЖХ позволяет проводить раздельное определение токоферолов и токотриенолов, эфиров токоферола, а также витаминов А и D [42, 98]. Детектирование различных соединений проводят как по поглощению, так и по флюоресценции.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИТАМИНА D

Количественное определение витамина в пищевых продуктах представляет собой чрезвычайно сложную задачу ввиду его низкого содержания, отсутствия чувствительных специфических реакций на витамин D и трудностей отделения от сопутствующих веществ. В связи с этим для многих продуктов с низким содержащем витамина D до недавнего времени единственно приемлемыми методами анализа являлись биологические исследования на крысах или цыплятах.

Би о логически е методы основаны на установлении минимального количества исследуемого продукта, излечивающего или предотвращающего рахит у крыс (цыплят), находящихся на рахитогенной диете. Степень рахита оценивают рентгенографически [20, 60] или пробой на черту [13]. Биологические методы обладают высокой специфичностью и чувствительностью, они позволяют определять витамин в концентрации 0,01-0,2 мкг%.

При исследовании пищевых продуктов с содержанием витамина D свыше 1 мкг% может быть использован колориметрический метод, основанный на реакции кальциферолов с хлоридом сурьмы [17, 68]. Метод позволяет определять как холе кальциферол (витамин D₃), так и эргокальциферол (витамин D₂). При наличии обеих форм витамина D, что может иметь место в витаминизированных пищевых продуктах, определяется их сумма. Анализ состоит из следующих операций: омыления (щелочного гидролиза), осаждения стеринов дипитонином, хроматографии (адсорбционная и распределительная) и колориметрической реакции с хлоридом сурьмы. Метод пригоден для определения содержания витамина D в рыбьем жире, натуральной печени трески, яйцах, сливочном масле, икре рыб, пищевых продуктах, обогащенных витамином. Несмотря на удовлетворительную точность, химический метод весьма трудоемок и длителен, поэтому мало пригоден для контроля обогащаемых продуктов.

Более быстрым, надежным и точным является все чаще применяемый метод ВЭЖХ, который успешно используется при анализе детских и диетических продуктов, обогащенных витамином D [53, 55, 69]. Его несомненным преимуществом является возможность идентифицировать, разделить и количественно определить другие жирорастворимые витамины в одной навеске образца [42, 81,98].

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ХОЛИНА

В природном материале холин содержится как в свободной, так и в связанной форме. Для определения холина в пищевых продуктах наиболее широкое применение нашел метод, основанный на образовании окрашенного соединения рейнека-тохолина при взаимодействии холина с аммонием рениевокислым (солью Рейнека).

Метод включает следующие операции: экстракцию, гидролиз в щелочной среде для освобождения связанной формы холина, осаждение холина в нейтральной среде в виде комплексного соединения солью Рейнека, отделение образовавшегося рейнекатохолина от сопутствующих соединений, растворение его в ацетоне и определение оптической плотности полученного раствора при длине волны 526 нм. Для экстракции холина из пищевых продуктов применяют метанол, гидролиз проводят с гидратом окиси бария.

Предложена модификация метода, которая позволяет сократить время анализа за счет одновременного проведения экстракции и гидролиза со смесью метанола, хлороформа и гидроксида бария. Холин выделяют из гидролизата адсорбцией на колонке с флоризилом. При пропускании рейнеката аммония через колонку получают рейнекат холина, который проявляется в виде розовой полосы, после того как избыток реактива отмоют. При наличии хлорофилла колонку до пропускания рейнеката аммония промывают метилацетатом. Рейнекат холина с флоризила элюирутот ацетоном и измеряют оптическую плотность раствора при 526 нм [62].

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Для определения витаминов В₆, В₁₂, фолацина, пантотеновой кислоты и биотина в пищевых продуктах используют в основном микробиологические методы анализа.

Разработке микробиологических методов анализа, в середине 40-х годов, предшествовало установление факта, что многие микроорганизмы, так называемые ауксогетеротрофы, для своего роста и развития нуждаются в тех или иных витаминах. Обычно потребность этих микроорганизмов в витаминах, получаемых извне, ограничивается одним, двумя, реже несколькими. Ауксогетеротрофы сильно различаются между собой и по степени потребности в готовых витаминах. Так, встречаются формы, которые совершенно не растут на средах, если требуемый витамин в них отсутствует. Именно эти микроорганизмы являются наиболее подходящими для количественного определения витаминов. Чувствительность подобного тест-организма к определяемому витамину будет особенно велика, что позволит выявить в естественных продуктах наличие самых малых его количеств.

Подавляющее большинство микробиологических методов количественного определения витаминов в пищевых продуктах основано на реакции роста микроорганизмов. Для того чтобы успешно использовать метод, требуется точно знать условия роста индикаторной культуры: необходимый состав питательной среды, условия культивирования.

В таких случаях обычный прием заключается в том, что питательная среда содержит все вещества, необходимые для роста, за исключением определяемого витамина. Интенсивность роста микроорганизма в этих условиях зависит в известных пределах от количества добавленного в среду витамина в виде его стандартного раствора или содержащегося в испытуемом гидролизате. После стерилизации и охлаждения, пробирки засевают тест-культурой и пробы помещают в термостат на определенное время. Затем измеряют реакцию роста тест-организма. Для этого может быть использован турбидиметрический метод, весовой метод определения массы микробных клеток, метод количественного определения образовавшихся кислых продуктов жизнедеятельности бактерий путем визуального при помощи индикатора или потенциометрического титрования. Содержание определяемого витамина в анализируемом материале находят путем сопоставления ответной реакции роста тест-организма в стандартной и опытной серии проб,

В качестве тест-организмов могут быть использованы бактерии, дрожжи, микроскопические грибы, простейшие и одноклеточные водоросли. Наиболее широко применяются для этих целей молочнокислые бактерии. Они не патогенны, хорошо растут в пробирках, продуцируют большое количество молочной кислоты, которая измеряется титрованием растворами щелочей.

Микробиологические методы имеют ряд преимуществ по сравнению с другими аналитическими способами. Они высоко чувствительны, благодаря чему до сих пор остаются незаменимыми при анализе некоторых объектов. Другой положительной особенностью является возможность определения витаминов в природном материале без дополнительных процедур, связанных с очисткой его от мешающих примесей, концентрированием витамина и другими приемами.

Однако высокая чувствительность некоторых тест-организмов, например Lactobacillus casei, предъявляет повышенные требования к чистоте посуды, реактивов, дистиллированной воды. К числу недостатков микробиологических методов анализа следует отнести их большую трудоемкость, длительность, а также способность некоторых микроорганизмов усваивать аналоги витаминов и их производные или отдельные части молекулы витаминов. Эти особенности должны учитываться при выборе тест-культуры и предпочтение следует отдавать той из них, которая проявляет наиболее высокую специфичность к требуемому витамину.

Существуют микробиологические методы для определения почти всех витаминов группы "В" (тиамин, рибофлавин, ниацин, витамины В₆ и В₁₂ фолацин, пантотеновая кислота, биотин). Из них при анализе пищевых продуктов в настоящее время сравнительно редко используются микробиологические методы определения тиамина и рибофлавина, которые почти полностью вытеснены химическими методами. При определении ниацина, витамина В₆ и пантотеновой кислоты применяют как микробиологические, так и физико-химические методы. Что касается витамина В₁₂, фолацина и биотина, то для их определения в пищевых продуктах микробиологические методы являются наиболее доступными и надежными.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИТАМИНА В₆.

Термин "витамин В₆" охватывает группу структурнородственных соединений, являющихся производными 2-метилпиридина, обладающих биологической активностью пиридоксина. К ним относятся: пиридоксин, пиридоксаль, пиридоксамин и их фосфорные эфиры. Все эти соединения в тех или иных количествах присутствуют в растительных и животных тканях. Большинство соединений, обладающих активностью витамина В_б, содержится в пищевых продуктах в виде комплексов с белками, они входят в состав различных пиридоксалевых ферментов, а также неспецифических белковых комплексов, не обладающих ферментативной активностью. Многочисленные исследования этих комплексов указывают на существование различных типов связей между витамином В₆ и белком и различную прочность этих связей. В связанном состоянии витамин В₆ можно определить только биологическим методом на животных, для микробиологических и физико-химических методов эти комплексы недоступны. Это условие создает большие трудности при определении витамина В₆ в продуктах питания.

Из-за многообразия связей усложняется расщепление комплексов витамина В₆, так как при этом требуются различные способы и условия обработки исследуемого материала перед его количественным определением. Обычно выделение витамина В₆ в свободной форме достигается автоклавированием образца с растворами серной или соляной кислот различной концентрации при различном давлении и продолжительности обработки. Для этой цели применяют также папаин, такадиастазу, кларазу [85], ферментный препарат из гриба Aspergillus огуzae [24]. При автоклавировании в кислой среде свободные формы витамина В₆ относительно стабильны, фосфорилированные формы подвергаются полному гидролизу.

В качестве тест-организмов при определении витамина В₆ чаще всего используют дрожжи Saccharomyces carlsbergensis 4228 и Saccharomyces Ludwigii KM. Метод с Saccharomyces carlsbergensis широко применяют за рубежом. Он простой, быстрый и дает хорошо воспроизводимые результаты. Этот тест-организм одинаково чувствителен к пиридоксину, пиридоксалю и пиридоксамину. В СССР чаще используют тест-организм Saccharomyces Ludwigii, так как для его роста необходима очень простая среда Ридер с добавлением четырех витаминов: никотиновой кислоты, тиамина, биотина и пантотената кальция [24].

Все формы витамина В₆ имеют одинаковую биологическую активность для человека и животных, и поэтому при анализе пищевых продуктов можно ограничиться определением суммарного содержаниявитамина В₆. Однако существуют методы, позволяющие дифференцированно определять и отдельные формы витамина.

Для раздельного определения лиридоксина, пиридоксаля и лири- доксамина применяют 3 тест-организма: Lactobacillus casei АТСС 7469 (отвечает реакцией роста на пиридоксаль), Streptococcus faecalis АТСС 8040 (реагирует на пиридоксаль и пиридоксамин) и Saccharomyces carlsbergensis или Saccharomyces Ludwigii КМ (чувствительны ко всем формам витамина В₆). Разработан также метод раздельного определения пиридоксаля, пиридоксина и пиридоксамина с использованием одного тест-организма Saccharomyces carlsbergensis, основанный на удалении из смеси пиридоксаля в форме неактивного оксима и отделении пиридоксамина на катионите РОА [36] .

Аналогичный способ определения отдельных форм витамина В₆ с организмом Saccharomyces carlsbergensis после их хроматографического разделения на колонках c Dowex AI-50W-X8 предложен Тоуп- фер и Лехманн [90].

Однако для раздельного определения различных форм витамина В₆ более удобным и быстрым является метод ВЭЖХ, который подробно описан в ряде последних работ [47 , 94, 96] . Проведенное сравнение метода ВЭЖХ с микробиологическим показало хорошую корреляцию и сходимость результатов [50] .

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИТАМИНА В₁₂.

Содержание витамина В₁₂ в пищевых продуктах определяют, используя в качестве тест-организмов бактерии Lactobacillus lactis АТСС 8000, Lactobacillus leichmani АТСС 7830, Escherichia coli 113-3, протозоа Ochramonas malhamensis и водоросль Eugena gracilis.

Чувствительность этих тест-организмов по отношению к витамину В₁₂ колеблется в пределах 10^-7-10^-10 (на 1 г или 1 мл исследуемого материала).

Все молочнокислые организмы имеют существенный недостаток, заключающийся в том, что наряду с витамином В₁₂ они могут использовать для роста тимидин и другие дезоксирибонуклеозиды. Кроме того, штаммы Lactobacillus реагируют в различной степени на ряд аналогов витамина В₁₂, не обладающих витаминной активностью для животных и человека. Преимуществом Lactobacillus leichmani является достаточно быстрая ростовая реакция и высокая чувствительность к витамину В₁₂. Поскольку в пищевых продуктах дезоксирибонуклео- зиды содержатся, как правило, в небольших количествах по сравнению с витамином В₁₂, их присутствие не влияет существенно на результаты, получаемые с Lactobacillus leichmani. Мешающие анализу вещества можно удалить перед анализом путем экстракции и очистки гидролизата с использованием хроматографической техники.

Наиболее быстрое (16-24 ч) определение витамина В₁₂ обеспечивает организм Escherichia coli 113-3. Этот микроорганизм не так чувствителен к витамину, как молочнокислые бактерии, но может расти на более простой среде и весьма удобен как тест-организм для повседневной практики. В отличие от молочнокислых бактерий мутант 113-3 не реагирует на дезоксирибонуклеозиды, однако вместо витамина В₁₂ он может использовать метионин. Поэтому метионин может явиться источником ошибок при -анализе продуктов, в которых его содержание достаточно велико. Escherichia coli 113-3 дает ростовую реакцию почти на все аналоги витамина В₁₂. Для получения точных данных эти мешающие определению соединения должны быть предварительно удалены из гидролизата [10].

Наибольшей специфичностью обладает метод с Ochramonas malhamensis, которая дает ответный рост только на "истинный" витамин В₁₂. Высокой специфичностью обладает также метод с использованием водоросли Eugenia gracilis. Однако применение его тормозится большой продолжительностью инкубационного периода (5-7 дней) и необходимостью поддержания условий хорошей освещенности.

Выбор тест-организма во многом зависит от свойств исследуемого материала. При этом учитывают наличие в анализируемом продукте веществ, мешающих определению. Для учета возможного их влияния ставят параллельные опыты с разными тест-органиэмами или с одним и тем же организмом при изменении условий обработки испытуемого материала. Поступают, например, следующим образом: определяют интенсивность роста микроорганизма при наличии витамина В₁₂ и мешающих анализу веществ. Одновременно определяют скорость его роста при наличии только мешающих веществ, разрушив витамин В,₂ 30-минутным кипячением образца при рН раствора 11,0.

При анализе пищевых продуктов витамин В₁₂ предварительно необходимо экстрагировать в форме, подходящей для микробиологического определения. Поскольку микроорганизмы отвечают ростовой реакцией только на свободные формы кобаламинов, перед анализом необходимо проводить гидролиз исследуемого продукта в слабокислой среде при авто к лавировании. Чтобы избежать падения активности малостабильных форм цианкобаламина, рекомендуется на 1 л среды добавлять 1 мг цианида калия.

Подготовка исследуемого материала к определению витамина В₁₂, техника микробиологических исследований, состав питательных сред, условия культивирования тест-организмов описаны в работах [10,13,71,82].

Кроме микробиологического метода при определении витамина В₁₂ в пищевых продуктах используют метод радио изотопного разведения [10, 74]. В настоящее время изучается возможность использования для этих целей метода ВЭЖХ, однако основная трудность состоит в невозможности определения крайне малых количеств витамина В₁₂ в обычном диапазоне детектирования [54].

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФОЛАЦИНА

Определение фолацина в пищевых продуктах затруднено тем, что в этих объектах он обычно присутствует в связанной форме в виде полиглутаматов, содержащих 3 или 7 молекул глутаминовой кислоты, с восстановленным птеридиновым ядром и присоединенными одноуглеродными фрагментами. Большинство форм фолацина весьма чувствительно к воздействию кислорода воздуха, света и температуры. При различных способах обработки, применяемых для освобождения связанного фола дина, они подвергаются окислению и расщеплению. Для предохранения фолацина от окисления проводят обработку исследуемого материала в присутствии аскорбиновой кислоты. Чтобы превратить полиглутаматы в более простые соединения, доступные для определения микробиологическими и физико-химическими методами, их подвергают обработке специфическими ферментами – коньюгазами. Для этого используют ферментные препараты, получаемые в лабораторных условиях из поджелудочной железы цыплят или из почек свиней.

В пищевых продуктах фолацин может быть определен химическими и микробиологическими методами. Усовершенствованный флюорометрический метод определения фолацина в пищевых продуктах, специфичность которого значительно повышена в результате предварительного осаждения белков и тирозина, мешающих флюорометрическому анализу [25], может быть использован при исследовании продуктов с достаточно высоким содержанием фолацина (печень, сыры, зелень петрушки, шпинат, морковь и др.). Однако для анализа объектов с низким содержанием фолацина, что свойственно большинству пищевых продуктов, основным методом является микробиологический. Несмотря на значительную трудоемкость, высокочувствительный и специфичный микробиологический метод находит широкое применение в лабораторной практике. Дифференцированный микробиологический метод с различными тест-организмами, обладающими специфической чувствительностью к отдельным формам фолацина, в сочетании с хроматографическим разделением этих соединений, используют при изучении распределения различных форм фолацина в пищевых продуктах [52].

При микробиологическом определении фолацина наиболее часто используют Streptococcus faecalis АТСС 8043, Lactobacillus casei АТСС 7469 и Pediococcus cerevisiae АТСС 8081. Из них Streptococcus faecalis менее требователен к условиям выращивания. Однако недостатком данной культуры является то, что Streptococcus faecalis может использовать для своего роста не только различные формы фолиевой кислоты, за исключением ее метального производного, но и птероевую кислоту, которая биологически неактивна для человека и животных. Так как в некоторых продуктах содержится довольно большое количество птероевой кислоты, при определении фолацина в пищевых продуктах с помощью Streptococcus faecalis могут быть получены завышенные данные.

Тест-организм Lactobacillus casei нечувствителен к птероевой кислоте и единственный из всех трех микроорганизмов реагирует на метилированные формы фолацина. Поэтому использование культуры Lactobacillus casei при анализе пищевых продуктов дает возможность получить более точное представление о фолацине, содержащемся в пищевых продуктах, доступном для человека и животных. Pediococcus cerevisiae отвечает положительной ростовой реакцией только на восстановленные формы фолацина.

Микробиологический, метод определения фолацина в пищевых продуктах с тест-организмом Lactobacillus casei подробно изложен в ряде работ [27, 52]. Весьма перспективным является также метод радиоконкурентного связывания [2], однако его широкое применение сдерживается необходимостью использования пока еще дефицитных специальных наборов реактивов (так называемых китов).

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПАНТОТЕНОВОЙ КИСЛОТЫ

Для количественного определения пантотеновой кислоты в пищевых продуктах применяют микробиологический метод, основанный на учете ростовой реакции микроорганизмов, не способных к синтезу этой кислоты, и зависящей от присутствия ее в питательной среде.

В пищевых продуктах пантотеновая кислота находится в свободном и связанном виде. Пантотеновая кислота в связанном виде недоступна микроорганизмам, поскольку не может проникать через стенки их клеток. Следовательно, при микробиологическом определении пантотеновой кислоты необходимо проводить предварительную обработку исследуемого материала, при которой произошел бы разрыв фосфатной и амидной связей в молекуле кофермента А. Щелочной и кислотный гидролиз для этой цели неприменим, так как витамин в таких условиях инактивируется. Применяют обработку изучаемых образцов ферментными препаратами.

Наиболее совершенным методом является обработка материала очищенной кишечной фосфатазой и пептидазой печени, при которой из кофермента А освобождается теоретическое количество пантотеновой кислоты, рассчитанной по содержанию β-аланина [18, 56] . Для этих же целей используют ферментный препарат из почек свиней, приготовляемый в лабораторных условиях. Хорошие результаты по освобождению пантотеновой кислоты получены при помощи ферментного препарата из гриба Aspergillus tericola [II].

При определении пантотеновой кислоты в качестве тест-организмов обычно применяют Lactobacillus casei АТСС 7469, Lactobacillus plantarum АТСС 8014, Saccharomyces carlsbergensis АТСС 4228 и Saccharomyces Ludwigii KM. При использовании молочнокислых бактерий необходимо предварительно освобождать исследуемые гидролизаты от липидов, стимулирующих рост данных организмов. Высокой чувствительностью и специфичностью по отношению к пантотеновой кислоте обладает дрожжевой организм Saccharomyces Ludwigii КМ. Он не реагирует на (3-аланин и диоксиметилмасляную кислоту и на смесь этих соединений. Кроме того,, состав питательной среды для Saccharomyces Ludwigii КМ значительно проще, чем для других тест-организмов. Техника проведения микробиологических исследований на содержание пантотеновой кислоты с организмом Saccharomyces Ludwigii КМ описана в ряде работ [14, 32, 56].

В качестве стандартного метода определения пантотеновой кислоты, рекомендованного для стран СЭВ, является метод с использованием культуры Saccharomyces Ludwigii 4228 (АТСС 9080). Институт вакцин и сывороток ЧССР (Прага) для этого метода разработал и производит сухую питательную среду, применение которой значительно упрощает проведение исследований.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ БИОТИНА

Биотин содержится в пищевых продуктах в очень малых количествах и в основном в связанной форме (с белками или пептидами). В связи с этим определение биотина в продуктах растительного или животного происхождения можно проводить только микробиологическим методом. Попытки определения биотина методом ВЭЖХ увенчались успехом только применительно к фармацевтическим препаратам, при анализе пищевых продуктов необходимы более чувствительные системы детектирования [54, 66].

В качестве тест-организмов при определении биотина микробиологическим методом используют истинные бактерии, дрожжи или грибы, для роста которых необходим биотин: Lactobacillus plantarum АТСС 8014, Lactobacillus casei АТСС 7469, Lactobacillus cerevisiae АТСС 7754, Candida tropicalis, Neurospora crassa.

Из всех перечисленных организмов наиболее широко используют Lactobacillus plantarum АТСС 8014, так как этот тест-организм обладает самой высокой специфичностью к свободному биотину. При определении биотина довольно часто применяют и дрожжевые методы с тест- организмами Saccharomyces cerevisiae АТСС 7754 и Candida tropicalis. Главным преимуществом дрожжевых методов являются широкие границы действия, что облегчает определение биотина в образцах, содержащих неизвестное количество витамина. Возврат добавленных количеств биотина при этом составляет 90-100%. Рост учитывается нефелометрически.

Для освобождения связанных форм биотипа исследуемые образцы автоклавируют в течение 7 ч при температуре 120° С в среде 2 н. раствора серной кислоты.

Определение биотина микробиологическим методом изложено в ряде руководств [12,28,51].