Для обнаружения и определения численности дрожжей в пищевых продуктах применяется ряд методов, которые по способу подсчета численности можно разделить на несколько групп: с использованием культивирования, наблюдение с помощью микроскопа, использование инструментальных методов.
12.2.1. Методы предварительной инокуляции
К классическим методам определения численности дрожжевых клеток, используемым в пищевой промышленности, относятся чашечный подсчет колоний, выращенных на культуральной среде, подсчеты после рассеивания (что для дрожжей более предпочтительно), внедрение мембранной фильтрации и определение наиболее вероятного количества микроорганизмов (Most Probable Number, МРN) [98]. Перед инокуляцией вереду культивирования может быть выполнено несколько предварительных этапов, в том числе отбор образцов, их подготовка и обработка, разбавление и, иногда, обогащение.
12.2.1.1. Отбор образцов
Планы выборочного контроля строятся на статистике, необходимой для оценки микробной нагрузки на пищевые продукты. Эти планы учитывают природу пищевого продукта (жидкий он или твердый), объем партии, размер образца и частоту пробоотбора. Их выполнение обусловлено стоимостью и затратами времени, а также необходимостью установить, будет ли их промышленное применение стоить затраченного времени и труда. Планы выборочного контроля особенно актуальны для пищевых продуктов, чувствительных к патогенной микрофлоре, а в тех отраслях промышленности, где производятся продукты, не способные создавать потенциальную угрозу для здоровья, выборочный контроль зачастую не имеет прочной статистической основы и основывается, главным образом, на практическом опыте. Обсуждение выборочных критериев выходит за рамки данной главы – подробнее об этом см., например, [7, 107].
12.2.1.2. Подготовка и обработка образцов
Эти операции очень важны для твердых или жидких пищевых продуктов, представляющие собой суспензии, по сравнению с чистыми жидкостями (вино, пиво), поскольку дрожжевые клетки с различной степенью интенсивности могут задерживаться на твердых поверхностях взвешенных частиц. Более сложная ситуация возникает при задержке клеток в ячеистых структурах некоторых пищевых продуктов, так как при этом клетки обычно лишаются подвижности и локализуются с высокой плотностью [78]. Применяемые для выделения дрожжей и плесеней процедуры размягчения и смешивания могут выполняться вручную путем встряхивания предварительного размолотого (при необходимости) образца в определенном объеме разбавителя, смешивания с разбавителем в лопастном миксере или сбивания в приборах Stomacher™(фирмы Colworth)или Pulsifier™(фирмы Кa1ух)[25]. В качестве разбавителей могут использоваться различные вещества, например, дистиллированная вода, солевой или фосфатный буфер и 0,1%-ный пептонный бульон (это наиболее распространенный разбавитель) [48]. Время контакта может варьировать от нескольких десятков секунд до нескольких минут (обычно 5-10).
Более интенсивные методы – энергичное перемешивание, водоструйное распыление и ультразвуковая обработка образцов – обычно используются для извлечения дрожжей из естественной среды обитания [138] или с поверхности замороженных пищевых продуктов [58]. Такая предварительная обработка перед выделением позволяет определить намного больше видов и КОЕ по сравнению с традиционными способами обогащения. Энергичное перемешивание в миксере Vortex читается более эффективным, чем водоструйное распыление или обработка ультразвуком [48].
12.2.1.3. Разбавление образцов
Для многих специалистов-микробиологов разбавление образцов – это рутинная операция, стандартная и безвредная для дрожжевых клеток. Существует мнение, что дрожжи более устойчивы к осмотическому шоку, чем бактерии, и поэтому состав разбавителя не имеет существенного значения. Тем не менее имеются сведения о том, что выдержка длительностью один [22]или два часа [141] вызывает значительное уменьшение популяции дрожжей независимо от типа разбавителя. Снижение численности дрожжевых клеток наблюдалось также при использовании 0,1%-ного пептонного бульона, который давал максимальное восстановление [141]. Такие периоды могут казаться слишком длительными для микробиолога-экспериментатора, но они вполне реальны в промышленных условиях, особенно когда берутся смывы с поверхности оборудования и установок с последующей инокуляцией питательных сред в лаборатории. Кроме того, периоды прививки более 1 мин могут значительно снизить число клеток в популяции [48]. В качестве разбавителя при подготовке образцов к посеву в чашки со средой общего назначения [191], к которой для лучшего диспергирования клеток в разбавителе может добавляться Тwееп 80, рекомендуется использовать 0,1%-ный стерильный пептонный бульон [18]. Не существует, однако, «идеального» разбавителя, особенно с учетом многообразия характеристик пищевых продуктов и биологического многообразия дрожжей. Например, ксерофильные дрожжи характеризуются более высоким процентом восстановления при разбавлении в 30%-ном растворе глицерина, чем в 0,1%-ном пептоном бульоне [5], а для обеспечения большего выхода Z. rouxii разбавление концентрированных фруктовых соков следует проводить с помощью 30%-ного раствора глюкозы [216]. Международная комиссия по пищевой микологии (International Commission on Food Mycology) признает, что в настоящее время отсутствуют специфические методики для различных типов пищевых продуктов, которые учитывали бы природу продукта или время контакта образца. Это существенно затрудняет сравнительную оценку результатов, полученных в различных лабораториях. Некоторые данные, основанные на международных совместных исследованиях; проведенных под эгидой вышеупомянутой комиссии, позволяют сделать вывод, что кроме состава разбавителя и времени между разбавлением и посевом в чашки на выживание клеток могут оказывать влияние и другие факторы - в частности, стадия жизненного цикла клеток, стресс, испытанный дрожжевыми клетками перед разбавлением, степень скопления и агрегации клеток, усилия сдвига во время встряхивания, присутствие ионов металлов, pН и температура [78]. Кроме того, не следует забывать, что главной целью является последующее восстановление ДВПП, так что условия разбавления должны способствовать их выделению. Вопреки общепринятому в пищевой промышленности мнению, разбавление отнюдь не является безобидной операцией, если учитывать необходимость последующего восстановления дрожжей.
12.2.1.4. Обогащение образцов
Операции обогащения обычно используются в пищевой бактериологии для обнаружения в пищевых продуктах патогенных видов микроорганизмов и небольшого числа других их видов. Для дрожжей такие операции применяют редко, поскольку до сих нор не ясно, приносят ли они пользу вообще. Как уже отмечалось выше, интенсивная и неразрушающая обработка образцов естественных субстратов дает лучшие результаты, чем обогащенные культуры [138]. Тем не менее те же ученые предлагают использовать обогащенные культуры для выявления сбраживающих видов дрожжей. Учитывая, что большинство ДВПП являются сбраживающими и присутствуют в пищевых продуктах и естественных субстратах в очень малых количествах, вполне возможно, что такая техническая операция может помочь их обнаружению. Кроме того, восстановление клеток, сублетально поврежденных тепловым, Холодовым, осмотическим или кислотным шоком, может потребовать применения специальных восстановительных операций [53, 77], которые одновременно могут иметь целью отбор микрофлоры, вызывающей порчу пищевого продукта [205].
12.2.2. Культуральные среды
12.2.2.1. Среды общего назначения
Среды общего назначения для выделения и определения численности дрожжей в пищевых продуктах являются в основном комплексом питательных веществ, содержащих в качестве источника энергии сахара (например, глюкозу, фруктозу, сахарозу), в качестве источника азота – усваиваемые белки (например, пептон, триптон, казитон) и комплексные витаминные добавки (дрожжевой или солодовый экстракт). Кроме того, они могут содержать (а могут и не содержать) один или несколько антибиотиков (в частности, окситетрациклин, хлорамфеникол), а также препарат, подавляющий развитие быстрорастущих плесеней (бенгал-роз, дифенил, дихлоран, пропионат натрия, олигомицин), иногда индикатор рН (например, бромкрезол зеленый или голубой) и агар (в зависимости от цели использования в качестве твердой или бульонной питательной среды) [130]. Результаты многочисленных исследований позволяют сделать вывод о том, что такие среды дают лучшие результаты для восстановления дрожжей, чем прежние, подкисленные органическими или неорганическими кислотами для получения значения рН около 3,5 [18]. К сожалению, все эти среды специально предназначены для восстановления наибольшего количества дрожжевых клеток, присутствующих в пищевых продуктах, при одновременной задержке роста бактерий и снижении роста мицелиальных грибов [48], и не являются специфическими для ДВПП. На самом деле это ограничение еще сильнее, чем может показаться, поскольку наиболее доброкачественные дрожжи отличаются быстрым ростом и тем самым ингибируют рост медленно растущих дрожжей, из которых некоторые являются самыми опасными ДВПП (например, Zygosaccharomyces spp; Dekkera spp.). Обычные среды, предназначенные для подсчетов общей численности жизнеспособных дрожжевых клеток, могут даже не поддерживать рост B. anomalus [21, 54]. Более того, на рост дрожжей, в частности на ДВПП, например, Z. rouxii, может влиять дихлоран-бенгал-роз-хлорамфеникольный агар (DRHC), широко используемый для обнаружения дрожжей в присутствии плесеней. [5]. Следует отметить, что с точки зрения контроля качества обычные культуральные среды, используемые в пищевой микологии, могут оказаться непригодными для получения «реальной картины» экосистемы пищевого продукта. Идеальная среда для установления численности дрожжевых клеток в пищевых продуктах должна предотвращать рост всех доброкачественных дрожжей и способствовать росту любых ДВПП, но поскольку это невозможно осуществить на практике, следует использовать другие стратегии, которые мы рассмотрим ниже.
12.2.2.2. Селективные и дифференциальные среды
Для самых разнообразных пищевых продуктов используется классический подход к разработке селективных сред, основанный на выборе рецептуры и условий инокуляции, благоприятных для конкретных групп дрожжей, таких как «кислотоустойчивые дрожжи», «ксеротолерантные/осмофильные дрожжи» или «психротрофные дрожжи», и при этом учитывается не таксономическая их значимость, а технологическое значение [45, 53, 77, 130]. Введение стрессовых факторов направлено на отбор одного или нескольких видов дрожжей, но при этом штаммы дрожжей с низкой устойчивостью к таким стрессовым условиям остаются неопознанными пли, наоборот, обнаруживаются высокоустойчивые штаммы дрожжей, которые были отнесены к чувствительным. Такая ситуация не обязательно будет иметь решающее значение для конкретного пищевого продукта, однако она может послужить сильным ограничением для широкого использования данной среды в пищевой промышленности. Например, что касается сред, разработанных для «кислотоустойчивых дрожжей», то среда ZBA оказывается весьма эффективной для обнаружения Z. bailii при использовании подкисляющих ингредиентов, в основном в присутствии уксусной и сорбиновой кислот [68]. Однако при испытании других штаммов, в других пищевых продуктах для восстановления Z. bailii она оказалась менее эффективной, чем среда общего назначения TGYA (Tryptone Glucose Yeast Extract Agar, триптон-глюкозный агар с дрожжевым экстрактом), подкисленная уксусной кислотой [103], особенно для клеток, подвергнутых тепловому стрессу в пищевых продуктах с высокой кислотностью и пониженным значением αω[131], а также в кислых напитках [132]. Для Z bailii в этих подкисленных средах восстанавливается такое же количество клеток, как и в средах с добавлением антибиотиков. Разница при этом состоит в том, что обычно использование антибактериальных препаратов увеличивает время инкубации. Такое свойство может пилиться полезным в том случае, если длительные инкубационные периоды являются дополнительной дифференциальной характеристикой штаммов (см. ниже). Для подсчета дрожжей в пищевых продуктах с низкими значениями αω (αω< 0,85) иногда необходимо использовать селективные среды, позволяющие учитывать ксерофильные виды дрожжей. В случае продуктов с умеренным влагосодержанием желательно использовать селективные среды в целях исключения конкуренции со стороны осмофильных дрожжей [5].
Было предложено несколько сред с высокими концентрациями сахаров [5, 32, 33], глицерина [104] или соли [5]. Среды с добавками глицерина (18%) предназначены для умеренно ксеротолерантных дрожжей, тогда как глюкоза (до 60% масс.) может использоваться для обнаружения и подсчета ксерофилов (от умеренных до экстремальных) [18]. Установлено, что наилучшим для восстановления ксерофильных дрожжей в присутствии ксерофильных плесеней является глицериновый агар с 18%дихлорана (DG18) [27], однако он не пригоден для использования в качестве среды для общего подсчета их численности [48]. По сравнению со средами общего назначения среды с пониженными значениями αωлучше восстанавливают клетки, сублетально поврежденные осмотическим шоком [5, 32], несмотря на достаточно продолжительный инкубационный период (10 или 28 сут) [18, 206]. Большинство ДВПП являются мезофильными, поэтому при инкубации используют температуры в диапазоне от 20-22 до 30°С [48]. Для обнаружения и подсчета психротрофных дрожжей уменьшение температуры на 5-7°С обусловливает приемлемость инкубационных периодов более 14 сут [18]. Кроме того, инкубацию следует производить, разметая чашки в вертикальном положении [191].
Другой подход заключается в использовании специфических ферментных свойств, общих для разных видов (например, для «липолитических» или «протеолитических» дрожжей [45, 53]) или присущих отдельному виду, в сочетании со стрессовыми факторами. Предшественником сред этого типа может считаться среда, предложенная в работе [34], которая позволяет четко идентифицировать патогенные дрожжи Cryptococcus neoformans за счет внесения 3,4-диоксифенилаланина (DOPA), преобразуемого этим видом в черный пигмент. Следуя этой стратегии и используя другие физиологические свойства для конкретных видов ДВПП, были предложены несколько специфических сред (см. табл. 12.1). Степень эффективности этих сред различна. Например, среда для Yarrowia lypolytica (Yarrowia lypolytica Medium, YLM) является полностью дифференциальной для Y. lypolytica благодаря уникальной способности этого вида дрожжей продуцировать коричневые пигменты из тирозина в течение 24 ч [30]. Дифференцирующая способность среды для Zygosaccharomyces (ZDM) основана на способности Z. bailii и Z. bisporus усваивать глюкозу и муравьиную кислоту при одновременном подщелачивании среды (индикация производится с помощью добавляемого в среду бромкрезола зеленого). Использование этой среды дает отличные результаты при исследовании вин [194], однако се дифференцирующая способность снижается при тестировании большего числа видов из других пищевых источников (D. hansenii, С. tropicalis, С, parapsilosis, Р. guilliermondii).
Дифференциальная среда для Dekkera/Brettanomyces (DBDM) позволяет определять D. bruxellensis и другие виды благодаря устойчивости к циклогексимиду и использованию в качестве единственного источника углерода и энергии этанола (6% об.). Дифференцирующая способность среды обеспечивается при использовании индикатора кислотности и р-кумаровой кислоты, предшественника 4-этилфенола, легко обнаруживаемого по фенольному запаху. Эта среда является эффективной для обнаружения D. bruxellensis в пробах вина [183], однако ее применение для других аналогичных пищевых объектов (виноград, виноградный сок) выявило присутствие Р. guilliermondii, вида, который в первое время считался основным продуцентом 4-этилфенола [57]. Для различия этих двух видов микроорганизмов необходимо учитывать другую особенность: колонии D. bruxellensis становятся видимыми не ранее, чем через 6-7 сут, тогда как колонии Р. guilliermondii проявляются уже через 2-3 сут. Эта особенность свидетельствует об ошибочном ограничении применяемых в настоящее время методик, согласно которому инкубация в течение 48–72 ч обычно считается достаточной для обнаружения дрожжей, присутствующих в пищевых продуктах. Это не всегда верно, особенно для медленно растущих видов ДВПП (таких, как Z. bailii или D. bruxellensis). Для них продолжительность инкубационного периода может колебаться от 10 до 14 сут (клетки, подвергшиеся воздействию консерванта) [216].
В пивоваренной и винодельческой промышленности на основе различных ферментных свойств и/или устойчивости дрожжей к стрессу были разработаны разные культуральные среды. В пивоварении важно отличать S.cerevisiae (дрожжи, используемые в производстве пива верхового или низового брожения), от «диких дрожжей», которыми могут являться отдельные нежелательные штаммы S. cerevisiae, другие виды Saccharomyces или дрожжи иных родов [29]. В этих целях были разработаны дифференцирующие культуральные среды, например, лизиновый агар (Lysine agar), среда Липа (Lip'smédium), дифференцирующая среда Шварца (Schwarz Differential Médium), среда кристаллическая фиолетовая (Crystal Violet Médium), среда с сернокислой медью (Copper Sulphate Médium), крахмальная среда (Starch Médium) [29, 48]. Для отличения диких дрожжей (включая дикие штаммы S. cerevisiae) от бродильных дрожжей в пиве низового брожения лучше всего проявила себя среда с сернокислой медью [113]. Росту диких и пивных дрожжей S. cerevisiae в пиве верхового брожения (в частности, в эле) [119] или диких штаммов S.cerevisiae [113] способствует повышение температуры инкубации от обычной (25°С) до 37°С. В качестве селективного реагента среды, разработанной для обнаружения дрожжей-вредителей вина, успешно использовался этанол (11,4% об.) [205]. Для выявления видов дрожжей, отличных от Saccharomyces, использовался лизиновый агар, а для подсчета S. cerevisiae более предпочтительна универсальная среда на солодовом агаре (Malt Extract Agar), чем этанолсульфитный агар (Ethanol Sulphite Agar) с 12% об. этанола и общим содержанием сульфита 150 мл/л [100]. Эта среда была разработана для обнаружения винных дрожжей в присутствии чрезмерно большого количества апикулятных дрожжей [111]. Кадаверин-лизин-этиламин-нитратный агар (Cadaverin Lysine Ethylamine Nitrate, CLEN-agar), селективный в пивоварении для видов, отличных от Saccharomyces [137], оказался непригодным в виноделии, поскольку стимулировал рост винных штаммов S. cerevisiae [74]. Существует среда, специально разработанная для обнаружения Dekkera spp. и Z. bailii в винах и основанная на их исключительной устойчивости к стрессу [81]. Вышеупомянутые среды ZDM и DBDM изначально были разработаны для винодельческой промышленности (табл. 12.1).
Таблица 12.1. Культуральные среды, предназначенные для подсчета целевых видов дрожжей, присутствующих в пищевых продуктах
| Среда | Целевые виды | Дифференциальные характеристики |
Целевой продукт | Источник |
| YLM | Yarrowia lypolytica | Коричневая окраска агаровой среды, содержащей тирозин |
Сыр | [30] |
| КDМ | Kluyveromyces marxianus, К. lactis | Голубые колонии, указывающие на присутствие галактозидазы при отсутствии лактозы в среде, содержащей Х-gal | Молочные продукты | [210] |
| ZDM | Zygosaccharomyces bailii, Z. bisporus | Голубые колонии, растущие на глюкозе и муравьиной кислоте; агар меняет цвет с зеленого на голубой | Вино | [194] |
| - | Debaryomyces hansenii, K. marxianus | Оранжево-розовые и темно-синие колонии в среде, содержащей соответственно Salmon-Gluс и Х-ga1 | Пищевые продукты умеренной влажности | [198] |
Во многих вышеупомянутых средах, как и в средах общего назначения, колонии дрожжей нужного вида дифференцируют по их морфологии, и поэтому результаты считаются предположительными. Дифференцирующие свойства среды усиливают путем добавления определенных красителей, в частности, хромогенных или флуорогенных субстратов (о способах действия красителей см. [83]). Вступая в реакции с определенными ферментами или их метаболитами, присутствующими в клеточной биомассе, эти субстраты вызывают образование ярко окрашенных или флуоресцирующих продуктов. Дополнительный дифференцирующий эффект за счет изменения цвета колонии и/пли среды обеспечивается путем внесения в среду наряду с красителями индикаторов кислотности. Именно так обстоит дело в случае молибдатного агара (Molybdate agar) с 0,125% пропионата, признанного дифференцирующей средой для нескольких видов дрожжей, выделенных из тропических плодов [179], или агара WLN в пивоварении [119] и виноделии [157]. Известна также схема выделения, основанная на выращивании штаммов дрожжей в трех дифференцирующих средах с последующим выявлением активности специфических ферментов. Она предназначена для обнаружения дрожжей в продуктах с высоким содержанием сахаров (марципан, фруктовые концентраты и сиропы) [197]. К основной питательной среде (дрожжевой солодовый агар) добавляют 1) эозин и метиленовую синь, 2) уксусную кислоту и 3) уксусную кислоту и теллурит калия. Активность трех видов ферментов определяют с помощью набора APIZym. Соблюдение последовательности всех трех процессов позволяет идентифицировать S, cerevisiae, D. hansenii, I. orientalis, Z. rouxii и Z. bailii. Хромогенный субстрат трифенилтетразолий, применяющийся для определения видов Candida spp. в медицине, не позволяет четко дифференцировать нужные виды дрожжей из-за их внутривидовой изменчивости. Несмотря на то что красители используются главным образом в клинической диагностике, реакция дрожжей на многие из них до сих недостаточно ясна [48, 83], хотя для определения штаммов дрожжей родов Candida, Hansenula, Kluyveromyсes, Pichia, Rhodotorula и Saccharomyces предложено несколько флуорофоров [86].
Вышеупомянутые среды предназначены для культивирования дрожжей в чашках Петри с предварительной мембранной фильтрацией или без нее, но они могут использоваться и в виде бульонов. В бактериологической практике широко используется классический метод «наиболее вероятного количества» (Most Probable Number, MPN) [98]. Ему незаслуженно не уделяют должного внимания при оценке численности дрожжей – возможно потому, что его считают менее эффективным, чем чашечный метод [48]. Тем не менее метод MPN вполне приемлем в тех случаях, когда образцы невозможно подвергнуть мембранной фильтрации, как, например, в случае суспензий типа крепленых вин [221]. Кроме того, этот метод оказывается необходимым при выявлении D. bruxеllensis, присутствующих в количестве менее 0,1% общей микрофлоры, и/или в присутствии плесеней, делающих невозможным выявление этого вида дрожжей на стандартных счетных пластинках [183]. Мы полагаем, что при использовании селективных сред метод MPN высоко эффективен для выявления и оценки небольшого числа бродильных видов дрожжей и ДВПП. В качестве обогатительных или восстановительных сред, а также для предотвращения роста плесеней могут использоваться и бульоны. Они позволяют отказаться от применения антибиотиков, которые способны влиять на рост дрожжей. Относительно редкое использование метода MPN в индустрии напитков по сравнению с посевом после мембранной фильтрации объясняется, возможно, более высокими трудозатратами и отсутствием серийно выпускаемых комплектов. Тем не менее промышленная система MicroCount™ фирмы Millipore успешно использует метод MPN дляавтоматического подсчета клеток после выращивания дрожжей на микропластинках в 24 лунках.
12.2.2.3. Промышленные среды
Селективные и дифференцирующие среды чаще всего не вызывают интереса у специалистов, занимающихся производством диагностических сред для пищевой промышленности (табл. 12.2). Большинство промышленных сред являются средами общего назначения, способными задерживать или замедлять рост бактерий или плесеней, и предназначенных для проведения клинических анализов. Нам известны только две «специальные» среды, используемые в производственных нуждах, причем обе предназначены для выявления Dekkera sp.: специальный бульон для Brettanomyces (Brettanomyces Specific Broth, BSM) фирмы Millipore и дифференцирующая среда для Dekkera Brettanomyces (Dekkera Brettanomyces Differential Médium, DBDM) фирмы STAB Vida. Селективная среда BSM содержит циклогексимид и глюкозу (20 г/л). Нами установлено, что культуральная среда с 20 г/л глюкозы не пригодна для обнаружения клеток Brettanomyces, поскольку сахар благоприятствует быстрорастущим видам дрожжей (например, К. apiculata, С. tropicalis, Р. guilliermondii) [183]. Таким образом, эта среда не является специфичной для Brettanomyces – это просто среда для выявления видов, устойчивых к циклогексимиду (в основном, быстрорастущих). Наши данные подтверждены практическими результатами, свидетельствующими, что восстанавливающиеся на среде BSM колонии видов дрожжей с мелкими сфероидными клетками и не относящиеся к роду Dekkera, неопытными лаборантами могут приниматься за дрожжи Dekkera [201].
Среда DBDM не содержит глюкозу, являясь частично селективной (благодаря циклогексимиду) и полностью дифференцирующей средой для Dekkera sp. В этой среде рост дрожжей рода Dekkera дифференцируется по четырем характерным признакам: медленный рост (более 5 сут), темнеющий со временем желтый цвет колонии, изменение окраски среды (с голубого на желтый) и образование фенольного запаха. Среда DBDM обеспечивает четкую идентификацию Dekkera sp. даже в образцах, контаминированных видами дрожжей, устойчивыми к циклогексимиду [57, 183]. В настоящее время среда DBDM защищена патентом.
Применяемые в клинической микробиологии среды для селективного и дифференцирующего восстановления патогенных дрожжей (см. табл. 12.2) основаны на различных ферментативных свойствах [80], но из-за своей целевой направленности (главным образом, на Candida spp.) они не представляют особой ценности для выявления наиболее опасных ДВПП. Тем не менее оценка их полезности проведена только но первым результатам исследований среды CНROMagar Candida, и чтобы убедиться в том, что различные структуры колоний некоторых видов ДВПП [48] наблюдаются также и промышленных условиях и характерны для многих их штаммов, необходимы дополнительные исследования.
Таблица 12.2. Культуральные дрожжевые среды, используемые в пищевой промышленности
| Наименование | Фирма-производитель1 | Назначение и принцип действия | Модификации и усовершенствования |
| Среды общего назначения | |||
|
Czapek Dox Agar2 (среда Чапека для дрожжей) |
Biomedics, Difco, EMSL, Fluka, HiMedia, Lab.Conda, Merck, Oxoid | Химически селективная среда для культивирования и сохранения плесеней и дрожжей. В качестве единственных источников углерода и азота содержит соответственно сахарозу и нитрат. В этих условиях способны расти только неприхотливые бактерии | Эти среды могут быть селективными для дрожжей и плесеней при добавлении антибиотика для подавления роста бактерий (например, хлорамфеникола стрептомицина, гентамицина и т. д.), или при подкислении среды (например, до рН 3,5). |
| Malt Extract Agar3 (солодовыйагар) | ВВL, Difco, EMSL, Fluka, HiMedia, Lab.Conda, Merck, Oxoid | Среда общего назначения для обнаружения, установления численности и культивирования дрожжей и плесеней. Ее состав особенно благоприятен для роста этих организмов | |
| Mycological Agar (микологический агар) | Difco | ||
| Potato Dextrose/Glucose Agar4 (декстрозо-глюкозный картофельный агар) | Biomedics, BBL, Difco, EMSL, Fluka. HiMedia, Lab.Conda, Merck, Oxoid | ||
| Yeast Extract Agar (агар с дрожжевым экстрактом) | HiMedia, Lab.Conda, Mast, Merck, Oxoid | ||
| Yeast и Mould Agar (плеснево-дрожжевойагар) | bioMerieux, Difco, Oxoid | ||
| Cooke Rose Bengal Agar (бенгальский розовый агар Кука) | Difco, HiMedia | Среда общего назначения для обнаружения, установления численности и культивирования дрожжей и плесеней; бенгал-роз ограничивает размер и рост распространяющихся плесеней. | |
| WLN, Wallerstein Laboratories Nutrient Agar (питательный агар лабораторий Уолерштейна) | BBL, Difco, Fluka, HiMedia, Merck, Oxoid | Эффективная среда общего назначения, поддерживающая рост дрожжей и бактерий. Содержит индикаторный краситель (бромкрезол зеленый), по-разному усваивающийся различными штаммами дрожжей. Поэтому смешанные культуры иногда проявляют себя в неоднородной структуре колоний (различные оттенки зеленого и белого). Оптимальным для определения численности пивных дрожжей является рН 5,5 |
• При исследовании пекарских или винных дрожжей необходимо довести рН до 6,5 (для повышения выхода) • При культивировании микроорганизмов из спиртосодержащего сусла в среду следует добавить томатный сок • Для подавления роста бактерий добавляют антибиотики |
| Селективные среды для дрожжей | |||
| Chloramphenicol (Glucose/Dextrose) Agar (хлорамфеникольный (глюкозо-декстрозный агар) | Biokar, Lab.Conda | Селективный агар для обнаружения и определения численности дрожжей и плесеней. Содержит хлорамфеникол для подавления бактериального роста | Для материалов с сильной бактериальной нагрузкой рекомендуется добавлять другие антибиотики (например, гентамицин, окситетрациклин и т. д.) |
| Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Agar, DRBCA (дихлорановый бенгал-розовый хлорамфеникольный агар) | Difco, Fluka, HiMedia, Lab.Conda, Merck, Oxoid | Селективный агар для обнаружения и определения численности дрожжей и плесеней. Содержит хлорамфеникол для подавления роста бактерий и бенгал-роз – для ограничения размера и роста распространяющихся плесеней. Бенгал-роз окрашивает колонии и тем самым облегчает их подсчет, а дихлоран тормозит быстрое распространение мукоровых грибов, а также ограничивает размер колоний других родов дрожжей, облегчая подсчет колоний | Эта среда чаще всего используется для установления численности и выделения дрожжей из пищевых продуктов, содержащих большое количество бактерий и плесеней. Для дополнительного ингибирования роста бактерий может потребоваться добавление другого антибиотика |
| Oxytetracycline Glucose Yeast (extract) Agar ,OGYA5' (окситетрациклин-глюкозный агар с дрожжевым экстрактом) | Difco, Fluka, HiMedia, Merck, Oxoid | Селективный агар для обнаружения и определения численности дрожжей и плесеней. Для подавления роста бактерий содержит окситетрациклин/ | Рекомендуется для образцов любых типов (пищевых продуктов, клинических анализов и т. д.). Для белковых пищевых продуктов или иных продуктов с большой бактериальной нагрузкой рекомендуется добавлять гентамицин |
| Rose Bengal Chloramphenicol Agar, RBCA6 (бенгал-розовый хлорамфеникольный агар) | Biokar, Difco, EMSL, HiMedia, Lab.Conda, Merck, Oxoid | Селективный агар для обнаружения и определения численности дрожжей и плесеней. Содержит хлорамфеникол для подавления бактериального роста и бенгал-роз для ограничения размера и роста распространяющихся плесеней. Бенгал-роз окрашивает колонии и тем самым облегчает их подсчет | Особенно рекомендуется для свежих белковых пищевых продуктов, в которых бактериальная флора в основном грамотрицательная. В случае образцов с очень большой бактериальной нагрузкой рекомендуется добавлять другие антибиотики (например, гентамицин, окситетрациклин и т. д.) |
| Sabouraud Dextrose Agar7 (декстрозный агар Сабуро, с антибиотиками или без них) | BBL, Biokar, Biomedics, bioMerieux, Difco, EMSL, HiMedia, int. Microbio, Lab.Conda, Mast, Merck, Oxoid | Преимущественно используется в фармакологии для определения численности дрожжей и плесеней в нестерильных материалах. Характеризуется высоким содержанием глюкозы для оптимизации роста грибков. Селективность среды повышается при низком значении рН и включении других антибиотиков |
Другие ингибиторы (хлорамфеникол, циклогексимид, гентамицин) добавляют в зависимости от сопутствующей микрофлоры: • Смесь циклогексимида, пенициллина и стрептомицина (при анализе дерматофитов для подавления контаминантов); • Хлорамфеникол и циклогексимид (в тех же целях); • Циклогексимид, колистин и новобиоцин – для выделения С. Albicans; • TTC (трифенилтетразолий хлорид) используют для различения С. Albicans: этот вид не окрашивается или дает бледно-розовый цвет, тогда как прочие виды Candida и другие грибы образуют темно-розовые или красные колонии |
| Yeast Glucose Chloramphenicol Agar, YGCA8, (дрожжевой глюко-зо-хлорамфеникольный агар) | BioMerieux. Difco, Fluka, Merck | Селективный агар для выделения и подсчета дрожжей и плесеней в молоке и молочных продуктах. Для подавления роста бактерий содержит хлорамфеникол | При подсчете дрожжей в образцах с большой плесневой нагрузкой (например, у сыров, в которых плесени используются для созревания) для подавления роста плесеней рекомендуется добавлять олигомецин |
| Селективные среды для групп дрожжей | |||
| Dichloran 18% Glycerol Agar. DG18 (глицериновый агар с 18% дихлорана) | EMSL, Merck, Oxoid | Селективный агар с низкой активностью воды (αω) служит для установления численности и выделения ксеротолерантных (осмофильных) дрожжей и плесеней в сухих и полусухих пищевых продуктах – в сухофруктах, мясных и рыбных продуктах, специях, кондитерских изделиях, крупах, орехах, в зерне и муке, а также в продуктах с высоким содержанием сахара (фруктовые концентраты, сиропы и основы напитков). Включение дихлорана тормозит быстрое распространение мукоровых грибов, а также ограничивает размер колоний других родов, облегчая их подсчет. Добавление хлорамфеникола и пониженные значения αωпредотвращают рост бактерий | Может также использоваться в качестве среды общего назначения для подсчета дрожжей и плесеней в разнообразных пищевых продуктах; добавление в агар DG18 препарата Triton-Х усиливает подавление интенсивно распространяющихся грибов |
| Lip's Wild Yeast Medium, LWYM9 (среда Липа для диких дрожжей) | Siebel L.T. | Для обнаружения и количественной оценки популяций диких дрожжей в культурных пивных дрожжах. Подавляет рост культурных дрожжей, в то время как дикие дрожжи образуют крупные отчетливые колонии. Эта среда специально разработана для стимуляции роста диких дрожжей рода Saccharomyces и содержит индикатор «кристаллический фиолетовый», ингибирующий рост пивных дрожжей. В этой среде может также расти ряд дрожжей, не относящихся к роду Saccharomyces | Если популяции диких дрожжей в основном не принадлежат к роду Saccharomyces, в качестве альтернативы используется среда LCSM [Lip's Cupric Sulfate Médium, фирма Siebel LT.), специально разработанная для стимуляции роста диких дрожжей, не относящихся к роду Saccharomyces |
| Lysine Medium9 (лизиновая среда) | Difco, HiMedia, Oxoid | Комплексная среда для выделения и подсчета диких дрожжей в засевных дрожжах (в пивоварении). Основана на использовании лизина: в отличие от многих других дрожжей, S. Cerevisiae и S. Carlsbergensis, включая и дикие, его не усваивают | |
| Schwarz Differential Agar (дифференцирующий агар Шварца) | Siebel L.T. | Питательная среда, позволяющая обнаруживать многие микроорганизмы, часто встречающиеся в пивоваренном производстве. Микроорганизмы, продуцирующие кислоты, определяют по образованию вокруг колоний чистых зон. Дальнейшую идентификацию облегчают характерные реакции пигментации | Для подавления роста культурных дрожжей в среду можно добавить циклогексимид |
| WLD, Wallerstein Laboratories Differential Agar (дифференцирующийагарлабораторийУолерштейна) | Difco, HiMedia | Рецептура WLD аналогична WLN, но для подавления роста дрожжей, чувствительных к циклогексимиду (актидиону, СНХ), в том числе Saccharomyces spp, добавлен СНХ. Если наблюдается рост Saccharomyces, то культура считается контаминированной | |
| Wort Agar (сусло-агар) | BBL Biokar, Difco, Fluka, Merck, Oxoid | Микологическая среда общего назначения; особенно подходит для культивирования, выделения и определения численности осмофильных дрожжей, в частности, в сливочном масле, сиропах, безалкогольных и других подслащенных напитках. Среда дублирует состав натурального сусла и по своей кислотности оптимальна для многих дрожжей, но при этом подавляет рост большинства бактерий |
|
| Селективные и дифференциальные среды для определенных видов дрожжей | |||
| Albicans ID | bioMerieux | Среда для выделения дрожжей и прямой идентификации С. albicans (голубые колонии), приготовленная на хромогенном субстрате, позволяющем обнаруживать β-галактозаминдазную активность | |
| Bismuth Glycine Glucose Yeast Agar, BiGGY Agar (висмут-глицин-глюкозный дрожжевой агар) | BBL, Biokar. Biomedics, Difco. HiMedia, Lab.Conda. Merck, Oxoid |
Рекомендуется для обнаружения, выделения и предварительной идентификации видов Candida. Сульфит висмута, подавляющий рост бактерий, метаболизируется Candida в сульфид, окрашивающий колонии в коричневый цвет. Типичные колонии: • С. albicans: колонии от коричневой до черной окраски без диффузии пигмента, без блеска; • С. krusei: яркие, «морщинистые» колонии от коричневой до черной окраски с черным центром; диффузия черного пигмента и блеск; • С. pseudotropicalis: плоские, блестящие колонии от красной до коричневой окраски без диффузии пигмента; • С. parakrusei: плоские, блестящие, «морщинистые» колонии темной красно-коричневой окраски со светлой красно-коричневой периферией и желтой каймой; • С. stellatoidea: плоские, темно-коричневые колонии со светлой каймой. Для более эффективного подавления роста сопутствующей бактериальной микрофлоры рекомендуется добавить другие антибиотики (например, неомицин) |
|
| Brettanomyces Selective Broth (селективныйбульондляBrettanomyces) | Millipore | Для обнаружения и определения численности Brettanomyces; селективная среда, содержащая ингибиторы роста других видов дрожжей (циклогексимид) или бактерий (антибиотик) | |
| Candichrom®ll | Int. Microbio | Комплексная субстратная идентификационная среда для выделения и установления численности дрожжей и прямой идентификации С. albicans | |
| Candida BCGAgar | Difco | При добавлении неомицина используется для первичного выделения Candida sp. | |
| Candida ID Agar | bioMerieux | Содержит хромогенный индолил-глюкозаминидный субстрат, который гидролизируется С. Albicans с образованием нерастворимого бирюзового или голубого продукта. С. Tropicalis, С. Lusitaniae и С. Guilliermondii выглядят розовыми, а другие виды Candida – белыми | |
| Candida Ident Agar | Fluka | Для селективного выделения С. Albicans из клинического материала. Содержит хлорамфеникол и хромогенную смесь. | |
| Candida Isolation Agar | Difco | Для первичного выделения и дифференциации С. albicans | |
| CandiSelect | Sanofi Diagnostics Pasteur | Хромогенная среда, основанная на хромогенном субстрате, для обнаружения β-галактозаминдазы; колонии С. albicans определяют по их голубому цвету | |
| CHROMagarTM Candida | Becton Dickson | Обеспечивает не только рост и обнаружение дрожжей подобно традиционным средам, но и содержит смесь хромогенных субстратов, позволяющих по цвету колоний быстро дифференцировать различные виды Candida: С. albicans (зеленая окраска) С. tropicalis (голубая окраска) и С. krusei (розовая окраска, размытая кайма) | |
| CHROMOGEN ALBICANS | Biomedics | Служит для предварительной идентификации С. albicans | |
| Dekkera Brettanomyces Differential Medium, DBDM (дифференциальная среда для Dekkera Brettanomyces) | STAB Vida | Для обнаружения и установления численности Brettanomyces. Содержит ингибиторы других видов дрожжей (циклогексимид) и бактерий (хлорамфеникол). Это также и дифференциальная среда, в которой рост дрожжей сопровождается изменением ее цвета (с голубого на желтый) и образованием фенольного запаха. Колонии имеют желтоватый цвет, который темнеет на протяжении инкубации | |
| MAST IDTM-CHROMagar® | Mast | Идентификационная среда, позволяющая одновременно обнаруживать и идентифицировать С. albicans, С. tropicalis и другие виды Candida за счет включения видоспецифичных хромогенных субстратов, обеспечивающих определение отдельных колоний по окраске, приобретаемой в течение их роста, а также по морфологии колоний | |
12.2.3. Методы чашечного подсчета и их варианты
Для определения численности микроорганизмов применяются способы, отличные от стандартных чашечных подсчетов (с использованием или без использования мембранной фильтрации) и разрабатываемые в основном для упрощения аналитических методов. Спиральная установка добавляет образец на пластинку (чашку), не требуя последовательного разведения [25]. Культуральные среды могут также вноситься в готовые к использованию модули, облегчающие инокулирование, систем Petrifilm™, Redigel™ и SimPlate™ которые позволяют получать результаты подсчетов, сравнимые с традиционным посевом в чашки [19, 20]. Система Compactdry™ состоит из инокулированного образца в центре способной к самораспространению среды, улучшенной растворимым на холоде загустителем и помещенной в одноразовую пластмассовую чашку [147], Метод фильтрации с использованием гидрофобной сетчатой мембраны позволяет увеличить количество разведений и получать образцы с высокой степенью контаминации [25]. Наблюдения через микроскоп за микроколониями, подкрашенными оптически активными или флуоресцентными красителями, и растущими на мембранах фильтра, обработанных оптическими осветлителями, обеспечивают быстрое обнаружение контаминантов [3, 29, 153, 158]. Это особенно удобно в случае непредвиденного сильного заражения образцов, например, вследствие внезапного разрыва стерильных фильтров, используемых при розливе вина в бутылки. Для облегчения подсчета колоний могут использоваться также методы анализа изображений [25, 158].
Анализ поверхности обычно выполняется путем взятия смывов на определенном участке и разведения в разбавителе с последующей инокуляцией в культуральную среду. В других методах используют повторные посевы, расплавленный агар, стерильные тампоны и т. д. (см. обзор [120]). Существует также автоматический метод с использованием клейкой ленты для взятия образцов микроорганизмов с поверхностей мяса [84]. Эта лента используется для получения образца и переноса его на поверхность агара. Инокуляция происходит через 15 с контакта, после чего производится подсчет числа колоний.
12.2.4. Методы прямого подсчета
Вышеуказанные методы требуют довольно большого времени, поскольку зависят от культивирования. Другие методы обеспечивают подсчет клеток, минуя этот этап, - например, способ непосредственного микроскопирования со счетной камерой (или без нее) и эпифлуоросцентная микроскопия. В оптической микроскопии для оценки жизнеспособности клеток могут использоваться разные красители (например, метиленовый синий и родамин S) [115]. В работе [60] отмечается, что толуидиновый синий является адекватным красителем для обнаружения микроорганизмов в пищевых продуктах in situ. Флуорохромное окрашивание обеспечивает большую чувствительность обнаружения, чем обычные красители, и может быть адаптировано к методам in situ(см. обзор [61]. Классическими примерами являются флуоресциндиацетат [159], анилиновый голубой [112] и акридиновый оранжевый, применяемые в методе прямой эпифлуоресцентной фильтрации (Direct Epifluorescent Filter Technique, DEFT) [47]. При использовании методов DEFT анализ сырого молока после лизиса соматических клеток [165] и суспензий твердых пищевых продуктов [164] занимает менее 30 мин с различной степенью корреляции со стандартными чашечными подсчетами. Иго применяют также при подсчете осмофильных дрожжей после 24-часового периода предварительной инкубации [162]. Проблемы взаимозависимости жизнеспособности клеток и снижения интенсивности флуоресценции можно обойти, используя замедлитель затухания Citiflúor AF2 [153] или окрашиванием сначала берберин сульфатом, а затем акридиновым оранжевым [160]. В настоящее время используют и другие флуоресцентные красители, например, SYTO 9, оксонол, пропидий иодид, FUN 1, SYBR Green II и карбоксифлуоресциндиацетат [44, 173, 228], которые применяются также при проточном цитометрическом анализе (о нем см. ниже). Кроме того, микроорганизмы можно подсчитывать непосредственно на поверхности клейких пленок с помощью флуоресцентной микроскопии [228].
Результаты, полученные с помощью метода DEFT, не всегда надежны [140, 184], но он обеспечивает экспресс-оценку результатов при подсчете микроколоний в случае концентрирования клеток [140]. Поэтому эти прямые методы могут оказаться очень полезны при контроле возможного заражения в реальном времени, в частности, при проверке степени пастеризации пива [160]. Кроме того, методы микроскопии не пригодны для проведения серийных анализов вследствие утомления операторов. Преодолеть этот недостаток помогают автоматические системы анализа изображений [82].
