Микроскопы, дающие увеличение в сотни (све­товой) или тысячи (электронный) раз, используют для изучения морфологии и строения микроорганизмов. Про­изводственные микробиологические лаборатории снабже­ны световыми микроскопами различных типов отечест­венного и импортного производства. Преимущество за бинокулярными микроскопами с автономной подсветкой и полным набором основных и дополнительных оптиче­ских систем.

3.1. СВЕТОВОЙ МИКРОСКОП

Микроскоп состоит из механической и оптиче­ской частей (см. рис. 2)

К механической части микроскопа относят штатив, который состоит из подставки (башмак) 9, придающей прибору устойчивость, и тубусодержателя.

К тубусодержателю 12 прикреплены:

Тубус 14, имеющий у различных моделей современных микроскопов конструктивные отличия.

В нижней части тубуса находится револьверный меха­низм 18 – вращающийся диск с гнездами для объективов, состоящий из двух пластин. Верхняя из них закреплена на­глухо, а нижняя с отверстиями и резьбой для объективов свободно передвигается, причем центрировка ввинченного в отверстие объектива фиксируется защелкивающейся пру­жинкой, попадающей в соответствующую прорезь.

Рис.2

Общий вид (а) и схема (б) микроскопа:

1 – микрометрический винт; 2 – макрометрический винт; 3 – стопорный винт; 4 – центрировочный винт для установки препарата; 5 – пружинные клеммы; 6 – винт для укрепления тубуса; 7 – сто­порный винт конденсора; 8 –  рукоятка перемещения диафрагмы; 9 – башмак микроскопа; 10 – ко­роб­ка с микромеха­низмом; 11 – кронштейн конденсора; 12 – тубусодержатель; 13 – окуляр;
14 – наклонный тубус; 15 – призма; 16 – головка тубусодержателя; 17 – винт для фиксации револьвера; 18 – револьвер на салазках; 19 – объективы; 20 – пред­метный столик; 21 –  конденсор; 22 – апертурная диафрагма; 23 – зеркало.

Предметный столик 20, круглый или прямоугольный с отверстием в центре для прохождения света. Столик можно передвигать при помощи винтов 4 в двух взаимно перпендикулярных направлениях. Для закрепления пре­парата на столике имеются специальные зажимы 5 раз­ной конструкции.

Механизм для передвижения тубуса вверх-вниз состо­ит из двух основных узлов – макро- 2 и микрометриче­ского 1 винтов.

Макрометрический винт (кремальера) служит для бы­строго поднятия и опускания тубуса при грубой настрой­ке. Один оборот зубчатого колеса позволяет перемещать тубус на 20 мм вверх или вниз.

Микрометрический винт предназначен для передви­жения тубуса при тонкой настройке и просматривания препарата в глубину. Полный оборот ведущего колесика продвигает тубус на 0,1 мм. Барабан винта разделен на 50 делений, каждое деление равно 0,002 мм.

Оптическая часть микроскопа состоит из осветитель­ного устройства, окуляров и объективов.

Осветительное устройство состоит из конденсора, ирис-диафрагмы и осветителя (или плосковогнутого зеркала).

Конденсор 21 применяют для концентрирования отра­женных зеркалом лучей света, фокус которых должен на­ходиться в плоскости препарата. Он состоит из двух линз, заключенных вместе с ирис-диафрагмой в общую цилин­дрическую оправу. Верхняя линза в конденсоре плоско­выпуклая, нижняя – двояковыпуклая. Весь конденсор можно пере­двигать вверх и вниз при помощи особого вин­та. При поднятии и опускании конденсора меняется угол сходимости лучей, в результате меняется и интенсивность освещения: при поднятом конденсоре – освещение ярче, при опущенном – слабее.

Под конденсором помещена апертурная (ирисовая) диафрагма 22. Ирис-диафрагма состоит из нескольких подвижных сегментов, сдвигаемых и раздвигаемых при помощи рычажка 8. Диафрагма установлена перед ниж­ней линзой конденсора и позволяет также регулировать освещение. Изменяя диаметр отверстия, через которое проходит пучок света, регулируют интенсивность освеще­ния поля зрения.

Если апертура конденсора меньше апертуры рабочего объектива, то из-за слабого потока света возможности лин­зы объектива задействованы не полностью. Если апертура конденсора больше апертуры рабочего объектива, что ха­рактерно для объективов малого увеличения, то уменьша­ют диаметр отверстия ирисовой диафрагмы конденсора.

Зеркало 23 подвижно закреплено под конденсором на особом рычажке, при помощи которого оно может быть установлено в любой плоскости. Одна его поверхность пло­ская, другая – вогнутая. При работе с конденсором ис­пользуют плоскую, без конденсора –  вогнутую поверх­ность зеркала. При дневном свете пользуются плоской сто­роной зеркала, при искусственном свете –  вогнутой.

При микроскопировании существенное значение име­ет освещение исследуемого объекта. Освещение чаще уста­навливают по методу Келлера.

1. Осветитель (при работе с зеркалом желательно ис­пользовать стандартные осветители ОИ-7 и ОИ-19, содер­жащие микролампу с небольшой плотно скрученной спи­ралью, которую можно передвигать вдоль оси осветите­ля) располагают на расстоянии 30–40 см от микроскопа.
2. На предметный столик ставят препарат, в рабочее положение переводят объектив 8×.
3. Конденсор поднимают до упора, полностью откры­вают ирисовую диафрагму.
4. Зеркало устанавливают плоской поверхностью и почти полностью закрывают диафрагму осветителя.
5. На зеркало помещают лист белой бумаги и, передви­гая патрон осветителя, доби­ваются четкого изображения на бумаге нити накала лампы.
6. Глядя в окуляр, при помощи зеркала получают в центре поля зрения изображение краев диафрагмы осве­тителя – светлое пятно с нерезко очерченными краями.
7. Используя объектив 8×, фокусируют объект в обла­сти светлого пятна.
8. Опуская конденсор, в плоскости препарата фоку­сируют изображение краев диа­фрагмы осветителя и дви­жением зеркала переводят светлое пятно в центр поля зрения.
9. Диафрагму осветителя открывают до тех пор, пока светлое пятно не закроет все поле зрения.
10. В дальнейшем положение зеркала, конденсора и диафрагмы осветителя больше не меняют.

При работе со встроенными стационарными осветите­лями правила настройки подробно изложены в инструк­циях по эксплуатации микроскопов.

Окуляр 13 вставляют в верхнюю часть тубуса. Увели­ченное объективом изображение дополнительно увеличи­вается окуляром, но новых деталей структуры при этом не наблюдается. Обычно окуляр состоит из двух плоско­выпуклых линз – глазной и собирательной, – обращен­ных своими выпуклыми поверхностями вниз к объекти­ву. Линзы заключены в общую металлическую трубку, между линзами находится диафрагма поля зрения мик­роскопа. У современных биологических микроскопов имеются окуляры с увеличениями в 7, 8, 10 и 15 раз. Размер увеличения указан на верхней оправе.

Объектив – основная часть оптической системы мик­роскопа, дающая увеличенное изображение предмета. Объ­ектив состоит из нескольких линз, помещенных в метал­лическую трубку и закрепленных канадским бальзамом. На верхней части трубки имеется резьба, при помощи ко­торой объектив ввинчивается в гнездо револьверной пла­стинки. Самая нижняя плосковыпуклая линза объекти­ва, обращенная к предмету, называется фронтальной; именно она позволяет получать увеличение, а остальные линзы только устраняют оптические недостатки изобра­жения (сферическую и хроматическую аберрацию); чем больше кривизна фронтальной линзы и меньше ее разме­ры, тем большее увеличение предмета дает объектив. Изо­бражение предмета обратное.

Современные биологические микроскопы обычно снаб­жены объективами с увеличением в 8, 10, 20, 40, 60 и 90 раз. Эти цифры указаны на объективе. При работе с объективами, увеличивающими в 60, 90 и более раз, фрон­тальная линза погружается в жидкость.

Важно получить не только увеличенное, но и четкое изображение исследуемого объекта.

Четкость изображения зависит от разрешающей спо­собности микроскопа, которую понимают как минималь­ное расстояние между двумя точками, при котором они видны раздельно. Разрешающая способность микроскопа зависит от числовой апертуры и длины волны используе­мого света.

Повысить разрешающую способность микроскопа мож­но за счет применения более коротких лучей света или, что более доступно, за счет приближения показателя пре­ломления среды, граничащей с линзой, к аналогичному показателю стекла. С этой целью прослойку воздуха меж­ду линзой объектива и предметным стеклом замещают спе­циальной жидкостью с показателем преломления, близким к показателю преломления стекла. Особенно это необхо­димо при использовании объективов большого увеличе­ния (60×, 90×) с фронтальными линзами малой площади.

Рис. 3

Ход лучей в сухом (а), водно- (б) и масляно-иммерсионном (в) объективе:

п – показатель преломления; РО – препарат; f – фронтальная линза объекти­ва; d – покровное стекло.

Показатель преломления стекла и воздуха составляет соот­ветственно 1,52 и 1,0, поэтому в качестве иммерсионных жидкостей, создающих оптически однородную среду меж­ду предметным стеклом и линзой объектива, чаще всего при­меняют кедровое масло
(п = 1,5), глицерин (п = 1,4), воду (n = 1,3). Ход лучей света при использовании обычного су­хого и иммерсионного объективов показан на рисунке 3.

Объективы для масляной иммерсии обозначают « МИ», водной – «ВИ».

Общее увеличение, даваемое системой объектива и окуляра, равно произведению увеличений окуляра и объ­ектива. Например, при окуляре 15× и объективе 40× уве­личение будет: 15 × 40 = 600 раз.

При работе с сильными объективами толщина покров­ного стекла не должна превышать 0,15– 0,18 мм ввиду ма­лого рабочего расстояния.

Под рабочим расстоянием объектива понимают рас­стояние от плоскости фронтальной линзы до изучаемого объекта при нахождении последнего в фокусе. Чем боль­ше увели­чение объектива, тем меньше рабочее расстоя­ние и поле зрения.

На корпусе объектива обозначена его увеличивающая способность (8×, 20×, 40×, 90×) и числовая апертура.

Числовая апертура А отражает количество света (рис. 4), попадающего в линзу.

Величина ее определяется по формуле

А = п sin и,

где А – числовая апертура линзы; п – показатель пре­ломления среды, граничащей с линзой; и – половина отверстного угла a.

Рис.4

Схема хода лучей при разном значении угла a:

А –  объект; О – объектив; и – половина отверстного угла.

Микроскопы необходимо хранить под чехлами или кол­паками для защиты от пыли. Удобно пользоваться чехла­ми из полиэтилена; не следу­ет оставлять микроскоп под солнечными лучами или в те­плом месте, так как может размягчиться клей, которым склеены линзы.

В комнате, где установлен микроскоп, не должно быть паров кислот и водяных паров. При переносе микроскоп следует брать только за тубусодержатель и следить за тем, чтобы окуляр не выпал из тубуса.

Для наружной очистки оптики применяют смоченные спиртом мягкие ткани, лучше фланель, не оставляющие после себя волокон. Использование ксилола и бензина для этих целей может привести к расклеиванию линз.

3.1.1. ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ  ОПТИЧЕСКИЕ СИСТЕМЫ

Фазово-контрастное устройство. Устройство включа­ет в себя: а) фазовую пластинку –  расположенный в зад­ней фокальной плоскости объектива прозрачный диск, на поверх­ность которого напылено кольцо из металлов (фа­зовое кольцо); б) кольцевую диафрагму –  помещенную под конденсором светонепроницаемую пластину с прозрач­ным кольце­вид­ным участком.

Световая волна при прохождении через живую клетку отстает по фазе приблизительно на 1/4 длины волны и до­полнительно сдвигается еще на 1/4 после прохождения через фазовую пластинку. Ход лучей в фазово-контрастном устройстве показан на рисунке 5. Сдви­нутые по фазе после прохождения через фазовую пластинку лучи либо совпадают и скла­ды­ваются с прямыми лучами, идущими мимо объекта, либо оказываются в противофазе. В пер­вом случае исследуемый объект виден как светлый на тем­ном фоне, а во втором – как темный на светлом фоне.

Рис.5

Схема хода лучей при использовании фазово-контрастного устройства:

1 – кольцевая диафрагма; 2 – кон­денсор; 3 – объект; 4 – объек­тив; 5 – фазовая пластинка.

Рис.6

Фазово-контрастное устройство КФ-4:

1 – конденсор; 2 – револьверный диск с набором кольцевых диа­фрагм; 3 – центрировочные винты; 4 – вспомогательный окуляр; 5 – на­бор фазовых объективов.

В микробиологии широко применяют фазово-контра­стное устройство КФ-4 (рис. 6) (объект виден темным на светлом фоне). Последовательность перехода к работе с фазово-контрастным устройством следующая.

1. Обычный конденсор заменяют на фазово-контрастный, а объектив 40× – на анало­гичный фазовый объектив.
2. Диск револьвера конденсора поворачивают до появ­ления в окошечке цифры 0; диафрагму конденсора пол­ностью открывают.
3. Используя объектив 8×, устанавливают освещение по Келлеру.
4. Обычный окуляр заменяют на вспомогательный и с помощью тубуса добиваются четкого изображения фазо­вой пластинки в виде темного кольца.
5. Устанавливают кольцевую диафрагму, соответст­вующую объективу 40×. В этом слу­­­чае наряду с темным кольцом фазовой пластинки можно видеть светлое коль­цо диафрагмы.
6. При помощи центрировочных винтов совмещают фазовое кольцо и кольцо диафрагмы.
7. Вспомогательный окуляр заменяют обычным и микроскопируют препарат.

При работе с другими объективами устанавливают со­ответствующие диафрагмы.

Темнопольный конденсор. При темнопольной микро­скопии используют специ­альный конденсор с затемнен­ной центральной частью, поэтому в плоскость объекта идут только боковые лучи, отраженные от внутренних зер­кальных поверхностей конденсора. Лучи направлены под таким углом, что не попадают в линзу объектива, и поэто­му поле зрения выглядит темным (рис. 7). Та часть лучей, которая попадает на объект, отражается в линзу объекти­ва, что позволяет видеть светлое изображение объекта на темном фоне.

Рис.7

Ход лучей в темнопольных конденсорах:

а – параболоид-конденсор; б – кардиод-конденсор;
1 – объектив; 2 – иммерсионное масло; 3 – препарат;
4 – зер­кальная поверхность; 5 – диафрагма.

Чтобы перейти к методу темнопольной микроскопии, поступают следующим образом.

1. Вынимают окуляр, светлопольный конденсор и вы­винчивают один из объективов (8×).
2. Прикрывают диафрагму осветителя и фокусируют нить накала лампы на листе белой бумаги, помещенном на зеркале. (Установка освещения по Келлеру.)
3. Раскрывают диафрагму осветителя, закрывают ма­товым стеклом конец тубуса и с помощью зеркала добива­ются равномерного освещения поля зрения.
4. Ставят на место окуляр, объектив 8×, темнопольный конденсор, положение зеркала при этом не меняют.
5. На линзу конденсора наносят каплю дистиллиро­ванной воды, на столик помещают препарат «раздавлен­ная капля» таким образом, чтобы вода на линзе конден­сора контактировала с нижней поверхностью предмет­ного стекла.
6. Глядя в окуляр, при помощи центрировочных вин­тов переводят в центр поля зрения свет­лое кольцо с тем­ным пятном в центре. Далее регулируют видимость объ­екта в поле зрения.

3.1. МИКРОСКОПИЯ

Приступая к работе с микроскопом, проверя­ют состояние конденсора: он должен быть поднят до уров­ня предметного столика, диафрагма открыта. Приподняв тубус микро­скопа, устанавливают объектив с наимень­шим увеличением (8×, 10×); глядя в окуляр, при помощи зеркала добиваются полного освещения поля зрения. За­тем на исследуемый препарат наносят каплю кедрового масла (или его заменителя), помещают препарат на пред­метный столик, поворотом револьвера устанавливают им­мерсионный объектив. (Чтобы избежать соприкосновения объектива со столиком, тубус следует держать приподня­тым.) Под контролем глаза (смотреть сбоку) фронтальную линзу объектива легким поворотом макрометрического винта погружают в каплю иммерсионного масла и, на­блюдая в окуляр, осторожно поднимают тубус до види­мости препарата. Затем легкими поворотами микромет­рического винта (вперед-назад) регулируют четкость изо­бражения.

При смене препарата тубус микроскопа поднимают, препарат снимают с предметного столика и, если исследо­вание проводилось с иммерсионной системой, фронталь­ную линзу объектива тщательно очищают от масла, про­терев салфеткой, смоченной спиртом.

В конце работы тубус приподнимают макровинтом, револьвер переводят в нейтраль­ное положение, масло с линзы осторожно снимают мягкой хлопчатобумажной тканью. Микро­скоп убирают в деревянный футляр или накрывают стеклянным колпаком (лучше из цветного стекла) для защиты от света.

Микроскопированием определяют морфологические особенности микроорганизмов, их тинкториальные свой­ства, подвижность, наличие специальных структурных элементов (спора, капсула).

Приготовленные препараты «раздавленная капля» и «висячая капля» просматривают с объективами 20× или 40×.

Фиксированные окрашенные препараты микроскопируют вначале с объективом 40×, потом – с объективом 90×. В правильно окрашенном и хорошо промытом препарате поле зре­­ния остается светлым и чистым, а окрашенными оказываются клетки микро­орга­низмов.

Чтобы исследовать под микроскопом живые нефикси­рованные неокрашенные микроорганизмы, используют особые оптические системы: фазово-контрастное устрой­ство и темнопольный конденсор.

3.3. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ В СВЕТЛОПОЛЬНОМ МИКРОСКОПЕ

Микроскопическое исследование микроорга­низмов проводят в живых или фиксированных окрашен­ных препаратах.

3.3.1. ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПРЕПАРАТОВ

Приготовление живых препаратов. Микроскопия кле­ток в живом состоянии применяется главным образом для изучения их размеров, формы, структуры, подвижности, характера размножения, отношения клеток к различным химическим раздражителям. С этой целью наиболее часто готовят препараты «раздавленная капля» и «висячая кап­ля». Микроорганизмы в этих препаратах можно подвергать прижизненной окраске. Так как большинство используе­мых в микробиологии красителей токсичны, для прижиз­ненного окрашивания микроорганизмов их используют в очень малых концентрациях от 0,001 до 0,0001%. В препа­рате «висячая капля» микроорганизмы можно наблюдать в течение продолжительного времени – неделю и более.

«Раздавленная капля». Готовят предметные и покров­ные стекла для микроскопии. Они должны быть чистыми и хорошо обезжиренными, чтобы нанесенная на них кап­ля равномерно растекалась. Достигается это несколькими способами. Стекла можно прокипятить 15 мин в 1%-ном растворе соды или в мыльной воде, сполоснуть водо­про­вод­ной водой, поместить на 5–10 мин в слабую хлористоводо­родную кислоту и хорошо промыть дистиллированной во­дой. Можно также готовить стекла к работе, выдержав их предварительно 2 ч в концентрированной серной кислоте или хромовой смеси. После это­го промыть их в проточной воде, прокипятить в 2%-ном растворе щелочи в течение 10 мин, тщательно промыть проточной, а затем дистилли­рованной водой. Обезжиренные предметные стекла можно приготовить, используя для этой цели кусочек мыла, ко­торым необходимо натереть рабочую поверхность стекла, а затем тщательно вытереть ее сухой салфеткой. Чистые стекла поместить на хранение в сосуды с притертыми пробками в смеси равных объемов спирта и эфира или в 96%-ный спирт.

Затем для приготовления препарата на чистое и обез­жиренное предметное стекло бактериологической петлей или пастеровской пипеткой наносят каплю исследуемой культуры. Если микроорганизмы находились в суспензии (в жидкой питательной среде), их наносят непосредственно на предметное стекло. Если же материал взят с плот­ной питательной среды, тогда его вносят в нанесенную предварительно на предметное стекло каплю стерильной водопроводной воды, стерильного физиологического рас­твора или какой-либо жидкой питательной среды. Мож­но также из культуры, выращенной на плотной питатель­ной среде, предварительно приготовить суспензию мик­роорганизмов. Для этого в пробирку с микроорганизмами, выросшими на агаровой поверхности, вносят 4–5 см³ сте­рильного физиологического раствора или водопроводной воды и, вращая про­бирку между ладонями, смывают мик­робные клетки с поверхности среды. Кроме того, можно в пробирку с 4–5 см³ стерильной воды бактериологической петлей перенести 1–2 колонии исследуемых микроорга­низмов, выросших на агаре в чашке Петри.

На предметное стекло на край капли опустить ребром под углом 45° покровное стекло и, осторожно наклоняя, накрыть им каплю так, чтобы в ней не образовались пу­зырьки воздуха (рис. 8).

Каплю нужно брать такой величины, чтобы она запол­няла все пространство между покровным и предметным стеклами и не выступала за края покровного стекла. Если жидкость будет нанесена в избытке, ее необходимо уда­лить при помощи полосок фильтровальной бумаги.

Рис. 8

Схема приготовления препарата «раздавленная капля»:

а – вид сверху; б – вид сбоку; / – пред­метное стекло; 2 – покровное стекло.

«Висячая капля». Для приготовления препарата «ви­сячая капля» взять стекло со шлифованной лункой. Края лунки смазать вазелиновым маслом. На покровное стекло стерильно в центр нанести каплю исследуемого материала (см. рис. 9). Затем предметное стекло перевернуть лункой вниз и поместить на покровное стекло так, чтобы капля нахо­дилась в центре лунки, не сопри­касаясь с ее краями. Предметное стекло легонько прижать к по­кровному и перевернуть. В об­разовавшейся герметичной ка­мере капля не высыхает, что позволяет наблюдать за микро­организмами продолжительное время.

Рис.9

Схема приготовления препарата
 «висячая капля»:

• – предметное стекло с лункой; 2 – капля; 3 – покровное стекло.

Приготовление фиксированных препаратов. Фиксированный окрашенный препарат микроорганизмов готовят в несколько этапов: приготовление мазка, высушивание его, фиксация и окрашивание.

Мазки готовят на чистых обезжиренных предметных стеклах из микробных суспензий или из культур, выра­щенных на плотных питательных средах. Если необходи­мо изучить естественное расположение микроорганизмов в колониях, выращенных на поверхности плотной пита­тельной среды или естественного субстрата, то готовят препарат-отпечаток.

Высушивают мазки или препараты-отпечатки при ком­натной температуре, так как высушивание при высокой температуре нарушает форму клеток.

На следующем этапе мазок фиксируют. При этом клет­ки прочно прикрепляются к поверх­но­сти стекла, повыша­ется их сродство к красителям и, наконец, клетки гибнут. Самый простой и распространенный способ фиксации – фиксация жаром, пригоден для наблюдения морфологии клеток, но не для изучения их строения, так как при воз­действии высоких температур структура клеток сущест­венно изменяется. Помимо жара, фиксацию можно про­водить химическими веществами (жидкостями и парами). Для этого исполь­зуют 96%-ный этиловый спирт (время фиксации 5–10 мин), смесь Никифорова, состоящую из абсолютного этилового спирта и эфира в соотношении 1:1 (10–15 мин), безводный метиловый спирт (3–5 мин), ацетон (5 мин), пары параформальдегида и др. Для дрожжей приоритетными являются химические методы фиксации.

Для химической фиксации микроорганизмов чаще всего используют следующие химические растворы:

1. Жидкость Карнуа:

Ледяная уксусная кислота.... 10 см³

Этиловый спирт, 96°............. 60 см³

Хлороформ............................ 30 см³

Хранить жидкость следует в бутылках с притертой пробкой. Она может храниться длительное время, но луч­ше пользоваться свежеприготовленным раствором. Жид­кость Карнуа является хорошим фиксатором для изуче­ния строения бактерий. Экспозиция фиксации 15 мин.

2. Смесь Никифорова:

Этиловый спирт, 96°............ 1 часть

Эфир..................................... 1 часть

Для фиксации препарат погружают в стакан с жидко­стью на 15-20 мин, после чего вынимают и дают возмож­ность подсохнуть.

3. Спирт-формалин:

Этиловый спирт, 96°............. 95 см³

Формалин................................ 5 см³

Для фиксации препарат погружают в стакан с жидко­стью на 15 мин, после чего выни­мают и дают возможность подсохнуть.

После фиксации препарат окрашивают. Большинство красок, применяемых в микробиологической практике, представляют собой соединения, чаще всего производные бензола и его гомологов, которые получают либо путем химического синтеза, либо из каменноугольной смолы. Они могут быть основными, кислыми и нейтральными. В лабораторных условиях можно быстро определить, ка­кой характер (кислый или основной) имеет водный рас­твор того или иного красителя. Для этого на фильтроваль­ную бумагу наносят каплю исследуемой краски. Так как фильтровальная бумага заряжена отри­цательно, то при основных свойствах краски вода растекается в виде бес­цветной зоны вокруг фиксированного пятна краски, при кислых – краска и вода растекаются одинаково. Основ­ные краски соединяются с веществами клетки, имеющи­ми кислые свойства, а кислые – с веществами с основ­ными свойствами. В практике микробиологических ис­следо­ваний чаще используются основные краски. Это объясняется тем, что большинство микроорганизмов не­сут на поверхности клетки отрицательный электрический заряд и в их цитоплазме преобладают вещества с кислы­ми свойствами. Исходя из сродства клеточных веществ к основным, кислым или нейтральным краскам, введены соответственно понятия «базофилия», «ацидофилия» и «нейтрофилия». Такое деление, однако, является относи­тельным, так как большинство клеточных веществ явля­ются амфотерными соединениями и в зависимости от зна­чения рН среды могут приобретать кислые, нейтральные или основные свойства.

В микробиологической практике наиболее употреби­тельными красками являются:

• красные – фуксин основной и фуксин кислый, ней­тральный красный, конго красный, эозин К, эритрозин;
• синие – метиленовый голубой, толуидиновый голу­бой;
• зеленые – малахитовый зеленый, бриллиантовый зе­леный, янус зеленый;
• фиолетовые – генциан фиолетовый, кристаллический фиолетовый, гематоксилин;
• коричневые – основной коричневый, хризоидин;
• желтые – пикриновая кислота, флуоресцеин;
• черные – индулин спирторастворимый, нигрозин во­дорастворимый и др.

Использование разных красок, их концентрация и продолжительность воздействия на клетки обусловлива­ются особенностями выявляемых структур и свойствами красителей.

Процедура приготовления фиксированного окрашен­ного препарата. С помощью стерильной бактериологиче­ской петли или пипетки Пастера нанести на тщательно обез­жи­ренное предметное стекло каплю суспензии мик­роорганизмов. Материал с плотных питательных сред взять бактериологической петлей и внести его в каплю стерильной водопроводной воды, предварительно нанесен­ную на предметное стекло. Микробный материал равно­мерно тонким слоем растереть на площади 1,5–2 см² и высушить приготовленный мазок при комнатной темпе­ратуре.

После высушивания мазок зафиксировать в пламени горелки. Держа стекло мазком вверх, трижды провести его через пламя горелки. Во избежание перегрева микро­организмов время прямого воздействия пламени не долж­но превышать 3–4 с. Для лучшего сохранения морфоло­гических параметров клетки целесообразно использовать химические методы фиксации.

Препарат поместить мазком вверх на мостик из двух параллельных стеклянных палочек, соединенных резино­выми трубками и находящихся на стенках кюветы или кристаллизатора.

Подготовленный таким образом препарат окрасить по методике, соответствующей поставленной задаче. Высу­шить его на воздухе или легко промокнуть фильтроваль­ной бумагой. Края стекла и тыльную сторону тщательно протереть салфеткой или фильтровальной бумагой. Таким образом препарат готов к микроскопированию.

3.3.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ РАЗМЕРОВ КЛЕТОК МИКРООРГАНИЗМОВ

Клетки микроорганизмов измеряют под микроскопом с помощью окулярной линейки-микрометра или окуляр­ного винтового микрометра. Для измерения лучше ис­пользовать живые, а не фиксированные клетки, так как фиксация и окраска приводят к некоторому изменению истинных размеров клеток. Размеры клетки удобно оп­ределять с помощью фазово-контрастного устройства. Если клетки подвижны, препарат слегка подогревают или к капле исследуемой суспензии добавляют каплю 0,1%-ного водного раствора агара. Размеры клеток вы­ражают в микрометрах.

Объективный микрометр (объект-микрометр) – это металлическая пластинка с отвер­стием в центре. В отвер­стие вставлено стекло, на ко­торое нанесена линейка дли­ной 1 мм (рис. 10).

Рис. 10

Объективный микрометр
(вид под микроскопом)

Она разделена на 100 частей, т. е. деление объектив­ного микрометра соответствует 0,01 мм, или 10 мкм. Для определения цены деления окулярного микрометра объ­ективный микрометр помещают на столик микроскопа и фокусируют при малом увеличении. Изо­бражение линей­ки перемещают в центр поля зрения и только после этого меняют объектив на тот, при котором будут определяться размеры клеток. Перемещая столик микро­скопа и пово­рачивая окуляр устанавливают микрометры так, чтобы их шкалы были параллельны, и одна перекрывала дру­гую. Цену деления окулярного микрометра определяют по принципу нониуса, т. е. совмещают одно из делений шкалы окулярного и объективного микрометров и нахо­дят следующее их совмещение (рис. 11). Устанав­ливают, скольким делениям объективного микрометра соответст­вует одно деление окулярного микрометра.

Пример. Два деления объект-микрометра (20 мкм) со­ответствуют пяти делениям окуляр-микрометра. Следова­тельно, одно деление окуляр-микрометра равно 4 мкм (20:5).

Если теперь на столик микроскопа поместить препарат с клетками микроорганизмов и рассматривать его при том же увеличении, то можно измерить величину клетки. Для этого определяют, какому числу делений окулярной линей­ки соответствует величина измеряемого объекта, и умно­жают это число на цену деления окулярного микрометра.

Рис. 11

Совмещение измеритель­ных линеек в микроскопе
(принцип нониуса):

• – шкала объект-микрометра; 2 – шкала окуляр-микрометра.

Окулярный микрометр (окуляр-мик­рометр) представляет собой круглую стек­лянную пластинку (рис. 12), в центре ко­торой выгравирована линейка длиной 5 мм. Линейка разделена на 50 частей. Окулярный микрометр вставляют в оку­ляр. Для этого вывинчивают глазную лин­зу окуляра, помещают на его диафрагму окулярный микрометр делениями вниз и завинчивают линзу.

Рис. 12

Окулярный микрометр
(в окуляре микроскопа)

Однако только с помощью окуляр-микрометра нельзя непосред­ственно измерить величину клетки, так как по­следние рассматриваются через объектив и окуляр, а де­ления линейки – только через верхнюю линзу окуляра. Поэтому, прежде чем приступить к измерению величины клеток, необходимо определить цену деления окулярного микрометра для данного увеличения микроскопа. Это де­лают с помощью объективного микрометра.

Винтовой окулярный микрометр (рис. 13) закрепляют на тубусе микроскопа, предварительно вынув окуляр. В оку­ляре винтового микрометра имеется неподвижная шкала с ценой деления 1 мм для определения размеров крупных объектов и подвижная стеклянная пластинка с перекрести­ем. Пластинка связана с микрометрическим винтом-ба­рабаном и перемещается вместе с перекрестием при его вращении. Для измерения длины клетки вращением мик­рометрического винта-барабана окулярного микрометра подводят перекрестие к концу клетки и отмечают деле­ние на барабане. Затем, вращая барабан, перемещают пе­рекрестие до другого конца клетки и вновь отмечают деле­ние на барабане. Определяют, скольким делениям микро­метрического винта-барабана соответствует длина клетки, и умножают полученное значение на цену деления бараба­на при данном увеличении микроскопа.

Рис. 13

Винтовой окулярный микрометр

Пример. Одно деление объективного микрометра, т. е. 10 мкм, соответствует X деле­ниям микрометрическо­го винта-барабана; следовательно, одно деление его при данном увеличении микроскопа равно 10:Х (мкм).

Цену деления барабана для каждого объектива опре­деляют с помощью объект-микрометра. С этой целью под­водят перекрестие к началу одного деления объективного микрометра и отмечают деление на барабане. Затем, вра­щая барабан, перемещают перекрестие до конца деления объективного микрометра и вновь отмечают деление на барабане. Определяют, скольким делениям микрометри­ческого винта-барабана соот­ветствует одно деление объ­ективного микрометра.

Для получения достоверных результатов необходимо измерить не менее 20–30 клеток. При определении разме­ров клеток округлых форм измеряют их диаметр, у кле­ток других форм – длину и ширину; указывают средние размеры клеток и пределы колебаний, т. е. минимальные и максимальные размеры.