Несоблюдение условий содержания коров может привести к значительному обсеменению молока микроорганизмами, тем самым создается возможность накопления в молоке ферментов микробного происхождения. Из этих ферментов – липазы, фосфолипазы и протеазы, аргиназа, декарбоксилазы и многие гликолитические ферменты играют существенную роль в изменении физико-химических показателей сырого молока, его питательной и биологической ценностей (гл. 1). От индивидуальных особенностей животных, их физиологического состояния (стельность, возраст) зависит активность некоторых ферментов молока.

Активность ксантиноксидазы в молоке, полученном от отдельных коров, даже в пределах одного стада и одной породы, может быть различна, что свидетельствует о важности генетических факторов в проявлении ее активности в молоке. Исследования показали, что в парном молоке от 131 коровы гернсейской и голштинской пород низкая ксантиноксидазная активность (28...30) была в молоке 29 коров, средняя (48...52) – в молоке 70 коров и высокая (75...80 мкл О₂/мл/ч) – в молоке 32 коров, т.е. различия по породам были незначительны (Zikakis J. Р., Treece J. М.). По данным И. А. Шумковой, в молоке отдельных групп коров холмогорской породы ксантиноксидазная активность различалась в 3 раза.

Индивидуальные особенности коров могут быть причиной развития в молоке спонтанного липолиза. Считают, что от 3 до 35 % коров в стаде продуцируют молоко, имеющее склонность к развитию в нем спонтанного липолиза. Указывают на возможную наследуемость продуцирования «спонтанного» молока.

При сравнении содержания лизоцима в молоке коров различного возраста. Установлено, что наибольшей его концентрация была в молоке здоровых коров в возрасте от 4 до 8 лет (Shahani К. М., Chandan R., Kelly Р. L.).

В отношении влияния физиологического состояния животных на активность ферментов молока следует отметить роль гормональной регуляции организма, которая в результате, например, применения машинного доения может определенным образом повлиять на «чувствительность» молока к спонтанному липолизу.

Заболевания коров. Различные заболевания коров ведут к снижению молочной продуктивности и изменению физико-химических показателей молока, в том числе его ферментативной активности. Мастит – самое распространенное заболевание, поражающее молочную железу. При воспалении молочной железы способность секреторных клеток к синтезу основных компонентов молока изменяется. Частично пораженная ткань становится проницаемой для компонентов крови. В молоке резко повышается содержание соматических клеток, основу которых составляют лейкоциты кровяного или лимфатического происхождения. Такое же явление наблюдается при попадании в молоко молозива или стародойного молока. При мастите происходит снижение содержания в молоке жира, казеина (в том числе β-казеина), лактозы, фосфорных и кальциевых солей, витаминов В₂ и С. В то же время повышается содержание сывороточных белков, ионов хлора и натрия.

В табл. 27 представлены данные, характеризующие изменение активности некоторых ферментов свежевыдоенного молока при заболевании коров маститом.

Таблица 27

Повышение содержания в молоке соматических клеток при заболевании коров маститом представляет собой большой потенциальный источник ряда ферментов, поскольку они являются активно метаболизирующими частицами, по крайней мере, в течение первых 24 ч после доения коров (Н. К. Оксамитный, И. П. Даниленко). В молоке даже с низкой бактериальной обсемененностью (менее 30 тыс. КОЕ/мл), но с высоким содержанием соматических клеток, в значительной степени изменяется дегидрогеназная активность (рис. 30, табл. 28).

Из табл. 28 видно, что активность лактатдегидрогеназы в молоке при мастите коров значительно повышается. При этом, если в нормальном молоке лактатдегидрогеназа имеет в основном (93 %) одну изоформу – Н₄, то в маститном молоке – три изоформы, а изоформа Н₄ составляет только около 35 % (Kitchen В. J, 1981).Повышение содержания в молоке соматических клеток при заболевании коров маститом представляет собой большой потенциальный источник ряда ферментов, поскольку они являются активно метаболизирующими частицами, по крайней мере, в течение первых 24 ч после доения коров (Н. К. Оксамитный, И. П. Даниленко). В молоке даже с низкой бактериальной обсемененностью (менее 30 тыс. КОЕ/мл), но с высоким содержанием соматических клеток, в значительной степени изменяется дегидрогеназная активность (рис. 30, табл. 28).

Установлена четкая зависимость активности лактатдегидрогеназы от количества соматических клеток в молоке, коэффициент корреляции между этими показателями молока достигает +0,83 (Sonneck R., 1979).

Активность ксантиноксидазы в молоке при мастите коров несколько повышается, что характерно не только для общей ее активности, но и для активности фермента, связанного с оболочкой шариков жира (по Grün Е., 1985).

Рис. 30. Влияние числа соматических клеток на дегидрогеназную (редуктазную) активность в сыром молоке (Mabbit L.A., 1981):

1 – 10⁵ КОЕ/мл молока, хранившегося 24 ч при 5°С; 2 – 10⁵ КОЕ/мл свежего молока; 3 – 10⁶ КОЕ/мл молока, хранившегося 24 ч при 5 °С; 4 – 10⁶ КОЕ/мл свежего молока

При заболевании коров маститом активность каталазы в молоке заметно повышается, что происходит в основном вследствие разрушения лейкоцитов, попавших в молоко, и высвобождения внутриклеточной каталазы, подобно лактатдегидрогеназе. Каталазная активность молока с примесью маститного всегда >25% О₂ (коэффициент корреляции между этими показателями составляет +0,72) (Kitchen B.J, 1985).

Определенный практический интерес для молочной промышленности представляет возможность использования величины активности аминотрансфераз в молоке в качестве теста на примесь анормального, в том числе маститного молока, поскольку эта активность в молоке при мастите коров заметно повышается, коэффициент корреляции между активностью в молоке аспартат- и аланинаминотрансфераз и содержанием в нем соматических клеток составляет 0,76...0,79 (Sonneck R., 1979).

Таблица 28

Заболевание коров клинической формой мастита вызывает значительное увеличение активности некоторых эстераз. Так, активность карбоксилэстеразы увеличивается почти в 40 раз, а коэффициент корреляции между этой активностью и количеством соматических клеток составляет около 0,8 (Kitchen В. J, 1981).

Тестом на определение примеси маститного молока в сборном молоке может служить активность арилэстеразы, так как этот фермент имеет в молоке только нативное происхождение. В связи с тем, что активность арилэстеразы в молоке заметно увеличивается не только вследствие заболевания коров маститом, но и, наряду с активностью холинэстеразы, при попадании в молоко примеси молозива (это повышение составляет соответственно примерно 6 и 13 раз по сравнению с активностью этих ферментов в нормальном молоке).

Усиление липолитической активности в анормальном молоке объясняют, с одной стороны, повышением уровня инфильтрации составных компонентов плазмы крови, с другой стороны, – значительным влиянием лейкоцитной липазы, а также изменением состояния ОШЖ, в результате чего происходят высвобождение липазы, связанной с микросомами ОШЖ, и сближение ее с субстратом – молочным жиром. В молоке с примесью маститного молока накопление СЖК может происходить в 1,5...2,0 раза быстрее, чем в нормальном. Отмечают, что пороки вкуса и запаха вследствие липолиза появляются при количестве соматических клеток в молоке (3,0...5,0) · 10⁶/мл (Downey W. К., 1980).

Показано, что при инфицировании молочной железы происходит перераспределение содержания липопротеинлипазы во фракциях молока (Anderson М., 1982) (табл. 29).

Из табл. 29 видно, что, хотя общая липолитическая активность молока при инфицировании четвертей молочной железы снижалась, отмечено увеличение активности липопротеинлипазы в сыворотке молока на 36 % без изменения при этом активности этого фермента в сливках. Установлено, что коэффициент корреляции между содержанием соматических клеток и активностью липопротеинлипазы в молоке составляет – 0,80. В то же время показано, что при содержании соматических клеток более 4 млн/мл активность фермента практически не обнаруживается (Лебедев А. Б., 1985).

Таблица 29

¹⁾ 1 ед. соответствует образованию олеиновой кислоты (1 мкмоль/мл/ч) при 20 °С.

При заболевании коров маститом в молоке повышается активность щелочной и кислой фосфатаз. Повышение активности кислой фосфатазы объясняют наличием этого фермента в молоке в основном лейкоцитного происхождения (Anderson М., 1983). Так, если нормальное молоко содержит одну изоформу кислой фосфатазы, то молоко коров, больных маститом, – три изоформы. При этом одна из форм сходна с фосфатазой лейкоцитов крови (молекулярная масса 42 000 Да, оптимум рН 5,8), вторая форма сходна с ферментом нормального молока и третья форма – с кислой фосфатазой лейкоцитов (оптимум pH 4,9).

Сообщается, что при различных заболеваниях и раздражениях, а также воспалениях молочной железы количество лизоцима М молока в пораженной четверти молочной железы резко снижается, или этот лизоцим исчезает вовсе.

Результаты исследований около 400 проб молока в различных хозяйствах Семипалатинской области показывают, что низкий титр лизоцима М отмечен в молоке коров, имевших упитанность ниже средней, чем у коров с расстройством ЖКТ и переболевших маститом. Нарушение нормального физиологического состояния, связанное с неправильным кормлением и нарушением функций молочной железы, вызывает снижение содержания лизоцима М в молоке (Шагиахметова Р. К., 1984).

Результаты определения различных показателей резистентности у клинически здоровых и больных маститом коров симментальской породы приведены в табл. 30 (Трусова О. С., Беляев В. И., Париков В. А., 1986).

Таблица 30

По данным ММФ (Бюл. 1991, № 264), содержание лизоцима в молоке коров, больных маститом, может увеличиться в 10 и более раз по сравнению с молоком здоровых коров (соответственно 100...200 и 10 мкг%).

Из лизосомальных гликозидаз, обнаруженных в молоке, активности β-галактозидазы, N-ацетил-β-глюкозаминидазы и β-глюкоронидазы при заболевания коров маститом увеличиваются. Так, например, активность N-ацетил-β-глюкозаминидазы может превысить уровень нормального свежевыдоенного молока почти в 6 раз. Ниже приведены данные по взаимосвязи активности этого фермента с содержанием соматических клеток (результаты анализа почти 1100 проб сборного молока от 180 поставщиков в течение 6 мес):

Коэффициент корреляции между числом соматических клеток и активностью N-ацетил-β-глюкозаминидазы в молоке достаточно высок и составляет 0,78...0,86 (Kitchen В. J. et al., 1984; Kerjean J. R., Dousset X., Blaise R, 1986).

В табл. 31 приведены данные по соотношению между наличием в сыром молоке коров β-глюкуронидазы, соматических клеток и потенциально патогенных микроорганизмов (анализ 200 проб молока вечернего удоя здоровых коров различного возраста и стадии лактации).

Таблица 31

¹⁾ В скобках дана степень наличия.

При этом только 17 % проб соответствовало нормальному молоку (соматические клетки – 300...500 тыс/мл при отсутствии потенциально-патогенных бактерий без наличия фермента), а в 2 % проб наличие фермента оценено одним крестом (+). Биологический профиль патогенной микрофлоры, выделенной из проб молока с высокой активностью фермента, составил: Str. agalactiae – 43 %, Е. coli – 10 %, Klebsiella – 5,6 %, Ps. aeruginosa – 1,1 % и Stph. aureus – 4,4 % (Perdigon G., Medici M. et al., 1985). Коэффициент корреляции между содержанием соматических клеток в пределах 0,25 · 10⁶... > 0,25 · 10⁶/мл и активностью β-глюкуронидазы составляет 0,71 (Kitchen В. J.).

При значительном содержании в молоке соматических клеток может обнаруживаться высокое содержание протеиназ, и в том числе лейкоцитного происхождения, но при этом α_s1- или β-казеин могут оставаться малогидролизованными. Электрофоретические фракции образцов гидролизованного казеина отличались от тех, которые были получены в результате действия плазмина, что означает включение в процесс протеолиза протеаз соматических клеток (Andrews А. Т., De Rham О., 1982; Kisza J., Sajko W., 1991). Установлено, что коэффициент корреляции между содержанием соматических клеток и активностью плазмина в молоке коров голштинской породы в течение всей лактации (от 43 коров – около 370 проб) составил 0,62. Увеличение содержания соматических клеток в молоке от 100 до 1300 тыс/мл вызывало увеличение активности плазмина в 2,3 раза (Politis J., Hang К. F. et al., 1989).

Общая протеолитическая активность молока коров, больных маститом (3 мес лактации), в 3...6 раз превышала этот уровень в молоке здоровых коров. При этом активность протеиназы, связанной с казеином, в молозиве коров, заболевших маститом в первые сутки после отела, была почти на 95 % ниже, а в молоке коров, заболевших маститом на 50...70 сут после отела, в среднем в 22 раза выше уровня этого фермента в молоке здоровых коров (Ипатова О. М., 1988). Показано, что содержание плазмина и плазминогена при субклиническом мастите увеличивается на 82 и 21% соответственно. Кроме того, мастит способствует частичному высвобождению этих ферментов из мицелл казеина.

При заболевании коров маститом отмечают значительное повышение в молоке активности альдолазы (2,5...10 раз, или с 0,06...0,12 до 0,65 нкат), что вполне объяснимо, так как одним из источников ее являются лейкоциты.

Таким образом, достаточно объективными тестами определения примеси анормального молока в свежевыдоенном молоке является определение активностей: лактатдегидрогеназы, каталазы, арил- и карбоксилтрансфераз, щелочной и кислой фосфатаз, N-ацетил-β-глюкозаминидазы, альдолазы, лизоцима, протеиназ и фруктозо-бифосфатальдолазы. Выбор того или иного теста будет определяться задачей исследования, степенью объективности, точностью и простотой используемых методов определения активности ферментов.

Массовое применение в ветеринарной практике антибиотиков для лечения маститов и зачастую нарушение ограничения на сдачу молока от коров, подвергнутых лечению, приводит к загрязнению ими молока. Попадая в молоко, антибиотики частично инактивируются компонентами молока, но вместе с тем воздействуют на его некоторые ферменты, например липазу. Липаза ингибируется некоторыми антибиотиками в концентрациях до 50 мг на 1 кг, а именно: хлортетрациклином на 9...42 %, пенициллином на 7...49, стрептомицином на 9...39 и окситетрациклином на 7...44 % (Мутовина О. В., Молочников В. В., 1978). Таким образом, низкая липолитическая активность молока может быть обусловлена не только его незначительной обсемененностью липолитически активными микроорганизмами, но и содержанием остаточных количеств антибиотиков, являющихся ингибиторами липаз. Поэтому при контроле липолитической активности молока важно определять и его антибиотическую активность. Имеются данные по воздействию некоторых антибиотиков на активность лизоцима в молоке. Так, введение коровам тетрамицина, пенициллина и некоторых других антибиотиков приводило к снижению активности лизоцима в молоке через 12...36 ч, однако через 48 ч после их введения активность лизоцима восстанавливалась (Shahani К. М.).

[1] 1 ед. активности – мкмоль образующегося n-нитрофенола/мл молока/мин при 37 или 50°С.